使用荧光剂进行染色之后在紫外激发的情况下使用荧光显微镜控制组织中的成像深度的系统和方法技术方案

本公开内容涉及用于分析组织样本的方法。在一个实现方式中，该方法包括获取组织样本并且将样本暴露于作为造影剂的一种或更多种荧光团以增强组织样本的亚细胞区室的对比度。组织样本被波长在约200nm至约400nm之间的紫外(UV)光照射，其中，波长被选择为导致穿透到组织样本的表面下方仅特定深度。在不同的成像参数下获取的图像之间的图像间操作使得能够经由去除不想要的图像分量而提高图像质量。可以使用显微镜对组织样本进行成像并且将图像提供给使用相机的图像获取系统。图像获取系统可以产生被传送到显示系统以用于进行处理和显示的相应图像。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用荧光剂进行染色之后在紫外激发的情况下使用荧光显微镜控制组织中的成像深度的系统和方法
本公开内容涉及用于在短波长(例如，紫外光)激发下、使用荧光显微镜来对人和动物组织的结构和分子进行成像的系统和方法，并且更具体地涉及以下系统和方法，该系统和方法能够对厚组织样本进行光学切片以获得近表面组织微结构的高分辨率图像，而不需要福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)，然后对组织样本进行切片机切片、或冷冻和切片，并且该系统和方法还能够与常规或新型的荧光染色剂和标记物一起使用，以使得能够对组织进行有效分析以用于诊断、组织成分和/或手术指导，例如监测活检样本的手术切缘区域是否存在肿瘤细胞。
技术介绍
本节中的陈述仅提供与本公开内容相关的背景信息，而可能不会构成现有技术。可以在细胞水平对组织提供功能和结构成像的技术在各个领域中是非常重要的。特别地，在临床实践领域，长期以来被认为是金标准的组织病理学诊断是基于对活检或手术切除物的薄的、染色的组织样本、尸体剖验或尸检得到的样本进行成像，完成该过程可能需要数小时到几天。理想地，能够在体内或在移除样本后非常快速地获得组织学、遗传或表型信息。我们将讨论快速显微系统的若干潜在应用领域，包括手术切缘评估、活检质量控制、快速诊断和快速分子表征。这些特征对于临床病理学应用很重要，并且在生物学、药理学和毒理学研究方面也很重要。此外，组织样本仍然可以在活生物体中原位存在，如对于皮肤或口腔粘膜，只要适当的成像光学元件可以接近其即可。手术切缘评估：对手术期间获得的活检的冷冻切片进行评估会是临床护理的常规部分，但是充满困难。这些困难包括取向、包埋、冷冻、切割、染色和观察所得染色切片所涉及的时间。对于每个样本而言，该过程可能需要10分钟或更长的时间。此外，大多数冷冻的样本的质量可能不是最佳的，并且通常低于福尔马林固定石蜡包埋(“FFPE”)的样本的质量。所造成的延误和分析挑战限制了术中活检或手术切缘评估的使用。因此，如果没有在术中进行切缘评估，则可能需要另外的手术。例如，20％至40％的乳腺癌手术必须重新进行以去除：手术切缘处或手术切缘附近存在的残留癌；理想地在最初手术过程期间会被检测到的癌沉积物。良好地认识到了对冷冻切片替换的需求并且许多团体和公司已在这方面做出努力。技术包括线扫描共焦系统、宽场OCT、多光子显微技术以及包括光散射、光谱学、电阻抗等的其他基于非成像的方法。活检质量控制是本公开内容旨在解决的另一方面。重要的是，活检，尤其是小的、相对非侵入性的针活检，含有目的组织。对于肾脏诊断，针活检必须含有肾小球；对于癌诊断，当然病变必须被适当采样，等等。在出于各种目的(例如组织病理学、流式细胞术、核酸提取)而必须分割样本的情况下，期望组织的每个等分试样均具有目的细胞或结构。此外，在一些情况下，重要的是估计可以表示肿瘤相对于基质的百分比为多少。具有快速检查活检组织以确保存在合适内容物的非破坏性方法会是有用的。移除的组织样本的快速诊断也是重要的。在进行确定诊断之前大多数移除的组织经历了常规FFPE处理，取决于工作流程，该处理引起几天或甚至几周的延迟。具有在活检或手术时进行诊断的能力能够减少延迟，减轻患者的痛苦，促进同日临床计划，并且降低总成本。移除的组织样本的快速分子表征也是重要的。类似地，许多分子测试，例如用于癌标志物或伴随诊断的免疫组织化学法或免疫荧光检验法(immunofluorescence)，直到初始组织诊断之后才被安排，并且引起几天至几周的额外延迟。拥有能够与同时进行的分子染色或者随后进行但快速的分子染色一起提供形态学确认的显微镜系统，则能够在同一天内生成所有必要的基于组织的信息，这对患者会是非常有益的，并且为服务提供者节省成本。劳伦斯利弗莫尔国家实验室(LawrenceLivermoreNationalLaboratory)和加利福尼亚戴维斯分校以前的工作引起了对用于解决这些问题(包括在体内成像中的应用)的新成像方法的开发。描述由该联合工作产生的主题的专利是Demos等人的美国专利第7,945,077号“HyperspectralMicroscopeforIn-vivoImagingofMicrostructuresandCellsinTissues”。授予Demos、转让给劳伦斯利弗莫尔国家安全有限责任公司的并且题为“In-vivoSpectralMicro-ImagingofTissue”的美国专利第8,320,650号也与组织中的微结构和细胞的体内成像有关。这两项专利通过引用并入本公开内容。在这两项美国专利中描述的技术使得能够使未经处理的组织样本中的细胞尺度的组织和组织结构可视化。该成像技术利用两种物理机制或特性。第一种是使用仅浅表地穿透组织的紫外(UV)光。更具体地，取决于组织类型和波长，UV光仅穿透组织几微米到几十微米的量级。因此，在该浅表组织层中产生的荧光信号可以包含在与显微镜的景深相当的厚度内。斜角照射也用作限制处于任何给定波长的激发的光子穿透深度的手段。可以以各种方式定义穿透深度，例如以下深度，到达该深度的光剂量为入射光量的1/e(或另一预定分数量，例如10％)。第二种主要物理机制或特性是使用被分析的组织的细胞区室内的天然荧光团。包含在细胞室区内的提供天然的“染色”方法的天然荧光团(例如色氨酸、胶原蛋白、弹性蛋白、NADH)的浓度存在足够的可变性。此外，可以获得基于造影剂的发射的图像，并且基于造影剂的发射的图像可以与天然荧光团的图像组合以提供附加的分子信息。本公开内容的方法提供了几个能力，包括：1)使用天然组织荧光生物分子以及外源性染料和标记物进行图像获取；2)短图像获取时间(毫秒量级)；以及3)有助于结合到广泛的仪器设计中，包括手持式装置。重要的是，与在先使用的技术相比，本公开内容的方法简单得多且便宜得多。当与其他新兴技术相比时，这些是显著的优点。因此，在临床环境中，仍然需要减小或消除对活检的人和动物组织的冷冻切片评估的需要的系统和方法。更具体地，需要以下系统和方法，该系统和方法非常适合于对新鲜切除的组织样本的术中活检和/或手术切缘评估，而不需要对相对较大的组织样本进行耗时且昂贵的冷冻和物理切片，并且该系统和方法还非常适用于与常规荧光染色剂和标记物一起使用，以用于进一步对组织样本进行辅助评估、诊断和手术切缘分析。在动物研究领域，为了对身体功能进行基本了解，为了研究疾病的发作和进展，在药物发现及其他领域，需要以下仪器，该仪器能够提供对组织样本的快速且便宜的评估，而且该仪器不需要执行常规的耗时、技术上具有挑战性且相对昂贵的组织病理学评估。此处讨论的专利技术解决了许多上述需要。
技术实现思路
在一方面，本公开内容涉及一种用于分析组织的方法。该方法可以包括获取组织样本以及将组织样本暴露于一种或更多种荧光团，一种或更多种荧光团包括优先在组织或细胞成分中积累的荧光标记的分子探针或荧光染料。可以使用照射激发源照射组织样本的表面，该照射激发源具有波长位于约200nm至约400nm之间的紫外(UV)光源。波长可以被选择为有助于将UV光对组织样本的穿透限制在表面下方仅约所选择的深度。可以使用显微镜光学系统来对组织样本进行成像。可以使用从显微镜光学系统接收光学信息的图像获取系统来记录一个或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于分析组织的方法，包括：获取组织样本；使所述组织样本暴露于一种或更多种荧光团，所述一种或更多种荧光团包括优先在组织或细胞成分中积累的荧光染料或荧光标记的分子探针；使用具有波长位于约200nm至约400nm之间的紫外(UV)光源的照射激发源照射所述组织样本的表面，所述波长被选择为有助于将所述UV光进入所述组织样本的穿透限制为所述表面下方仅约所选择的深度；使用显微镜光学系统来对所述组织样本进行成像；使用从所述显微镜光学系统接收光学信息的图像获取系统来记录一个或更多个图像；以及使用与所述图像获取系统通信的显示系统来处理并且显示所述图像以用于分析。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.16 US 14/487,9971.一种用于分析组织的方法，包括：获取组织样本；使所述组织样本暴露于一种或更多种荧光团，所述一种或更多种荧光团包括优先在组织或细胞成分中积累的荧光染料或荧光标记的分子探针；使用具有波长位于约200nm至约400nm之间的紫外(UV)光源的照射激发源照射所述组织样本的表面，所述波长被选择为有助于将所述UV光进入所述组织样本的穿透限制为所述表面下方仅约所选择的深度；使用显微镜光学系统来对所述组织样本进行成像；使用从所述显微镜光学系统接收光学信息的图像获取系统来记录一个或更多个图像；以及使用与所述图像获取系统通信的显示系统来处理并且显示所述图像以用于分析。2.根据权利要求1所述的方法，其中，利用UV光照射所述组织样本包括：使用具有选自光波长的中心位于如下波长处或位于如下波长附近的波段的UV源：350nm；340nm；330nm；320nm；310nm；290nm；280nm；270nm；260nm；250nm；245nm；240nm；235nm；230nm；225nm；220nm；210nm；200nm；以及其中，所述UV源包括如下中至少之一：LED；激光器；可调激光器；或者连续源，所述连续源包括连续激光光源、电弧灯、激光点火电弧灯、氪-溴准分子灯或在期望光谱范围内具有足够亮度的其他源中至少之一。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本被支撑件支撑，所述支撑件由紫外透射材料形成，所述紫外透射材料能够包括石英、熔融二氧化硅、蓝宝石或包括聚甲基戊烯的UV透射塑料，使得进行如下配置中至少之一：所述支撑件能够被配置为平面窗口，所述样本能够被压靠到所述平面窗口以确保界面处的良好光学性质；或者所述支撑件能够被配置为可能是一次性的比色杯形状的物体，所述组织能够被引入所述比色杯形状的物体中，并且所述比色杯形状的物体提供4个或更多个平坦的或者可能弯曲的表面以用于进行周围成像。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或更多种荧光染料或荧光标记的分子探针被选择用于增强通常在显微镜下观察并且包括如下项中至少之一的组织或细胞成分的对比度：细胞核；细胞质；细胞膜；以及线粒体。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或更多种荧光染料或荧光标记的分子探针被选择用于增强在显微镜下观察并且包括如下项中至少之一的组织或细胞成分的对比度：亚细胞器；脂质；细胞外组织成分，所述细胞外组织成分包括包含胶原的结缔组织和细胞外基质中至少之一；囊肿内容物；异物；感染性媒质；色素；用于取向的外源标记染料；在分子探针的情况下：特异性蛋白质；翻译后修饰；包括基因、染色体区域或DNA成分的特异性DNA或RNA序列；编码性和非编码性的RNA转录本；以及脂质筏。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述荧光团包括能够在从350nm至200nm的光谱范围中被充分激发并且在350nm至950nm的光谱范围中具有有用的发射波段的组织学或组织化学荧光染料，并且所述荧光团包括如下项中至少之一：曙红染料家族、甲苯胺蓝O、亚甲基蓝、DAPI、吖啶橙、DRAQ5、Hoechst33342和33528、钙黄绿素AM、碘化丙啶、尼罗蓝、尼罗红、油红O、刚果红、固绿FCF、DiI、DiO、DiD等、YO-中性红、核固红、焦宁Y、酸性品红、阿司屈拉崇家族染料、MitoTracker和其他线粒体染料、LysoTracker和其他溶酶体染料、番红染料、硫黄素染料、荧光毒伞素、质膜染色剂、与感染性媒质结合的荧光化合物。7.根据权利要求1所述的方法，其中，包括抗体和相关分子、适体、SomamersTM、核酸寡聚物、LNA的分子探针与荧光标记物直接或间接复合，以及其中，所述荧光标记物包括以下标记物类别中至少之一的成员：碳纳米管、碳量子点、包括荧光素、罗丹明、Alexa染料、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、德克萨斯红、香豆素基荧光团、IRDye800、吲哚菁绿、氟硼吡咯、DyLight染料、俄勒冈绿、藻红蛋白的有机荧光标记物、稀土元素、半导体量子点、有机量子点、聚合物点(pDots)、包括二氧化硅珠、聚合物囊泡、卟啉基胶束和脂质体的荧光纳米粒子、以及FRET基染料缀合物。8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或更多种荧光团与结合细胞外成分、细胞或亚细胞成分内的特异性分子的分子探针偶联，或者所述一种或更多种荧光团被相对于正常上皮或基质不同的细胞类型或感染性媒质优先吸收或差异处理，以及其中：如果向患者施用具有期望组织或细胞特异性的一种或更多种荧光化合物，则在组织切除之前，在患者中(体内)发生标记过程；在组织切除或取样之后，在能够支持细胞存活力的条件下进行离体短期培养期间，包括在含氧的、温热的组织培养基中维持期间，发生标记过程；或者在不需要存活力的条件下，包括在免疫荧光或原位杂交条件下暴露于探针，在细胞或组织中发生标记过程。9.根据权利要求1所述的方法，其中，使用作为如下项中至少之一而工作的图像获取系统：2维面传感器，所述2维面传感器包括CCD、cMOS、ICCD或EMCCD相机等中至少之一，以使用天然组织分子的荧光和/或造影剂的荧光来记录来自组织样本的区域的至少一个图像；或者点检测器，所述点检测器逐点扫描所述组织样本的一部分，以使用天然组织分子的荧光和/或造影剂的荧光来生成来自组织样本的区域的至少一个图像；或者线检测器，所述线检测器逐行扫描所述组织样本的一部分，以使用天然组织分子的荧光和/或造影剂的荧光来生成来自所述组织样本的一部分的至少...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯塔夫罗斯·G·德莫斯，理查德·利文森，
申请(专利权)人：劳伦斯·利弗莫尔国家安全有限责任公司，加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US