事件特异性检测方法技术

本发明专利技术涉及鉴别重组马铃薯植物(包括由此类植物制成的食物产品)中的遗传物质的方法。本发明专利技术涉及本文所述方法中所用的材料，包括核苷酸引物和探针。另外，本发明专利技术提供由基因重组事件产生的非天然存在的核苷酸接合序列本身，和检测所述接合序列的方法。

Event specific detection method

The present invention relates to methods for identifying genetic material in recombinant potato plants, including food products made from such plants. The present invention relates to materials used in the methods described herein, including nucleotide primers and probes. In addition, the present invention provides a non naturally occurring nucleotide binding sequence produced by a genetic recombination event, and a method of detecting the bonding sequence.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】事件特异性检测方法相关申请案的交叉参照本申请要求2014年10月10日所提申的美国临时专利申请第62/062,324号和2015年2月19日所提申的美国临时专利申请第62/118,320号的优先权，其完整内容各自全部结合在此供参考以用于所有目的。用电子方式提交的文本文件的说明用电子方式随同提交的文本文件的内容全部结合在此供参考：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名：JRSI_062_02US_SeqList_ST25.txt，记录日期：2015年10月04日，文件大小≈26千字节)。
本专利技术涉及鉴别重组马铃薯植物(包括由此类植物制成的食物产品)中的遗传物质的方法。另外，本专利技术涉及本文所述方法中所用的材料，包括核苷酸引物、探针和非天然存在的核苷酸接合序列本身。
技术介绍
马铃薯是全世界第四种最重要的食物作物且至今是最重要的蔬菜。目前美国的几乎每个州都商业种植马铃薯。马铃薯年产量在美国超过1800万吨且在全世界超过3亿吨。马铃薯的畅销主要来源于其通用性和营养价值。马铃薯可以新鲜、冷冻或干燥使用，或可以加工成面粉、淀粉或酒精。其含有复杂的碳水化合物且富含钙、烟酸和维生素C。食品工业中的马铃薯品质受两个关键因素影响：(1)马铃薯含有大量的天冬酰胺(一种在油炸或烘烤时会快速氧化形成丙烯酰胺(一种致癌产物)的非必需游离氨基酸)；和(2)马铃薯极易发生酶促褐变和变色(当多酚氧化酶从碰损的马铃薯中的损伤质体外渗时发生的非期望事件)。在细胞质中，酶使苯酚发生氧化，其然后快速聚合而产生深色的色素。块茎含有大量的磷酸化淀粉，其中一些在储存期间降解而产生葡萄糖和果糖。这些还原糖当在超过120℃的温度下加热时与氨基酸反应而形成梅纳产物(Maillardproducts)，包括丙烯酰胺。涉及淀粉磷酸化的两种酶是水二激酶R1和磷酸化酶-L(R1和PhL)。褐变也作为淀粉部分降解成葡萄糖和果糖的结果而以非酶促方式触发。为了解决前述两个因素，现在已经研发出马铃薯植物变种，其产生的块茎的丙烯酰胺含量低、黑斑碰伤耐受性增强且还原糖含量降低(美国专利第8,754,303号，“马铃薯栽培品种J3”；美国专利第8,710,311号，“马铃薯栽培品种F10”；美国专利第8,889,963号，“马铃薯栽培品种J55”；美国专利申请第14/072,487号，“马铃薯栽培品种E12”；和美国专利第8,889,964号，“马铃薯栽培品种W8”，其还耐受晚疫病，所述文献各自全部结合在此供参考)。这些被改造的马铃薯植物是通过引入遗传事件而非将来自细菌的外来核酸引入马铃薯中来研发。然而，工业中对用于鉴别这些被改造的马铃薯植物(包括由此类植物制成的食物产品)中所引入的遗传物质的方法和材料存在着巨大的需求。具体地说，对确定所指定的马铃薯或马铃薯产品是否含有所引入的特定遗传转化事件的方法和材料存在着需求。
技术实现思路
本专利技术提供鉴别植物中的遗传转化事件的方法。在一些实施例中，植物是马铃薯。本文阐述的方法广泛地用于检测由植物转化产生的非天然存在的核苷酸接合点。在一些方面中通过农杆菌(Agrobacterium)介导载体发生的植物转化事件产生了非天然存在的独特核苷酸接合序列，所述接合序列可以利用本专利技术方法检测。这些转化事件可以在任何植物物种中检测到，然而，在举例说明的某些实施例中，本文教导的方法教导了检测八种马铃薯栽培品种中的非天然存在的核苷酸接合点。在一些方面中，本专利技术提供了能够检测已转化的马铃薯的方法和材料，所述马铃薯包含所插入的核酸序列，所述核酸序列是马铃薯植物基因组原生的且不含农杆菌DNA(病毒标记)或载体骨架序列。相反，插入马铃薯变种基因组中且被本文所述方法实施例检测的DNA可以是非编码聚核苷酸，其是马铃薯原生的或野生马铃薯原生的，或马铃薯性相容植物原生的。所引入的这些核苷酸对于涉及表达黑斑碰伤、天冬酰胺聚积和还原糖聚积的基因起着静默作用。因此，所引入的这些基因引起已转化的马铃薯中的丙烯酰胺含量降低。另外，本文教导的方法能够检测到引入马铃薯中的赋予晚疫病抗性的基因，且在一些方面中能够检测到编码聚核苷酸。所插入的前述DNA产生了非天然存在的独特核苷酸接合点，所述核苷酸接合点在自然界中未被发现。因此，本文教导的转化事件促成了非天然核苷酸“接合”序列在已转化马铃薯中的产生。非天然存在的这些核苷酸接合点可以当做一种指示特定遗传转化事件的存在的诊断类型来使用。如前所述，本文教导的方法不限于马铃薯。相反，本文中所利用的八种马铃薯栽培品种表明了本专利技术方法适用于检测任何植物物种中的由植物转化所产生的非天然存在的核苷酸接合序列。本专利技术技术能够通过利用特殊的定量PCR方法(包括独特设计的引物和探针)检测到非天然存在的这些核苷酸接合点。在一些方面中，本专利技术的探针结合到非天然存在的核苷酸接合序列。在一些方面中，利用传统PCR。在其它方面中，利用实时PCR。在一些方面中，利用定量PCR(qPCR)。因此，本专利技术涵盖利用两种常见方法实时检测PCR产物：(1)插入任何双股DNA中的非特异性荧光染料，和(2)由寡核苷酸组成的序列特异性DNA探针，所述寡核苷酸经荧光报告基因标记，从而允许只在探针与其互补序列杂交之后检测到。在一些方面中，只有非天然存在的核苷酸接合点将通过所教导的引物扩增，且因此可以通过非特异性染料或通过利用特异性杂交探针检测。另外，通过产生非天然存在的核苷酸接合序列(由所揭露的转化事件产生)，本专利技术人已经创造出在自然界中未发现的独特核苷酸序列。这些序列可以加以分离且包含不存在于自然界中的核苷酸分子，产生此类分子无需人工干预。另外，结合到非天然存在的核苷酸接合序列的所揭露探针序列也是自然界中未发现的新核苷酸分子。因此，本专利技术的方面涉及非天然存在的核苷酸接合序列分子本身，以及能够在轻度到严格杂交条件下结合到所述非天然存在的核苷酸接合序列的其它核苷酸分子。在一些方面中，能够在轻度到严格杂交条件下结合到所述非天然存在的核苷酸接合序列的核苷酸分子称为“核苷酸探针”。因此，在本专利技术中，描述了检测E12、F10、J3、J55、V11、W8、X17和Y9遗传转化事件的代表性方法。本专利技术提供了检测非天然存在的核苷酸接合序列的方法，所述核苷酸接合序列是由前述转化事件产生。这些八个实例充当能够检测任何植物物种中的非天然存在的核苷酸接合序列(由转化事件产生)的较大属中的种类。在一个实施例中，提供一种用于检测核酸样品中的植物转化事件的存在的定量PCR方法，所述方法包含：a)将以下组合：i)一对正向和反向核苷酸引物，ii)核苷酸探针，和iii)来自包含待检测的非天然存在的核苷酸接合点的所述样品的目标核苷酸序列；其中核苷酸探针结合到非天然存在的核苷酸接合点，或指示非天然存在的核苷酸接合点的存在的序列；和b)检测来自所述样品的目标核苷酸序列。在一个态样中，非天然存在的核苷酸接合点是由选自由以下组成的群组的植物转化事件产生：E12、F10、J3、J55、V11、W8、X17和Y9，或其组合。在一些方面中，非天然存在的核苷酸接合序列发现于食物产品材料中。在特定方面中，食物产品材料是马铃薯食物产品材料。在一个态样中，目标核苷酸序列包含至少一种选自由SEQIDNO:1-48组成的群组的核苷酸序列。在一个态样本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测核酸样品中的植物转化事件的存在的定量PCR方法，所述方法包含：a)将以下组合：i)一对正向和反向核苷酸引物，ii)核苷酸探针，和iii)来自所述样品的包含待检测的非天然存在的核苷酸接合点的目标核苷酸序列；其中所述核苷酸探针结合到所述非天然存在的核苷酸接合点，或指示所述非天然存在的核苷酸接合点的存在的序列；以及b)检测来自所述样品的所述目标核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.10 US 62/062,324;2015.02.19 US 62/118,3201.一种用于检测核酸样品中的植物转化事件的存在的定量PCR方法，所述方法包含：a)将以下组合：i)一对正向和反向核苷酸引物，ii)核苷酸探针，和iii)来自所述样品的包含待检测的非天然存在的核苷酸接合点的目标核苷酸序列；其中所述核苷酸探针结合到所述非天然存在的核苷酸接合点，或指示所述非天然存在的核苷酸接合点的存在的序列；以及b)检测来自所述样品的所述目标核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述非天然存在的核苷酸接合点是由选自由以下组成的群组的植物转化事件产生：E12、F10、J3、J55、V11、W8、X17、Y9，或其组合。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标核苷酸序列包含至少一种选自由SEQIDNO:1-48组成的群组的核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述正向和反向核苷酸引物对和所述核苷酸探针是选自由SEQIDNO:52-90组成的群组。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述正向核苷酸引物包含SEQIDNO:52且所述反向核苷酸引物包含SEQIDNO:53且所述核苷酸探针包含SEQIDNO:54。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸探针结合E12事件的左侧或右侧的所述非天然存在的核苷酸接合点。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述正向核苷酸引物包含SEQIDNO:55且所述反向核苷酸引物包含SEQIDNO:56且所述核苷酸探针包含SEQIDNO:57。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸探针结合F10事件的左侧或右侧的所述非天然存在的核苷酸接合点。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述正向核苷酸引物包含SEQIDNO:58且所述反向核苷酸引物包含SEQIDNO:59且所述核苷酸探针包含SEQIDNO:60。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸探针结合J3事件的左侧或右侧的所述非天然存在的核苷酸接合点。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述正向核苷酸引物包含SEQIDNO:61且所述反向核苷酸引物包含SEQIDNO:62且所述核苷酸探针包含SEQIDNO:63。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸探针结合J55事件的左侧或右侧的所述非天然存在的核苷酸接合点。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述正向核苷酸引物包含SEQIDNO:64或67且所述反向核苷酸引物包含SEQIDNO:65或68且所述核苷酸探针包含SEQIDNO:66或69。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸探针结合V11事件的左侧或右侧的所述非天然存在的核苷酸接合点。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述正向核苷酸引物包含SEQIDNO:70且所述反向核苷酸引物包含SEQIDNO:71且所述核苷酸探针包含SEQIDNO:72。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸探针结合W8事件的左侧或右侧的所述非天然存在的核苷酸接合点。17.根据权利要求1所述的方法，其中所述正向核苷酸引物包含SEQIDNO:73且所述反向核苷酸引物包含SEQIDNO:74且所述核苷酸探针包含SEQIDNO:75。18.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸探针结合X17事件的左侧或右侧的所述非天然存在的核苷酸接合点。19.根据权利要求1所述的方法，其中所述正向核苷酸引物包含SEQIDNO:76且所述反向核苷酸引物包含SEQIDNO:77且所述核苷酸探针包含SEQIDNO:78。20.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸探针结合Y9事件的左侧或右侧的所述非天然存在的核苷酸接合点。21.根据权利要求1所述的方法，其中所述正向核苷酸引物包含SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶劲松，杰弗里·W·哈比希，雅内·莱恩，杰弗里·W·海因，马修·G·彭斯，斯特凡妮·胡敦，
申请(专利权)人：杰尔辛普洛公司，
类型：发明
国别省市：美国,US