基因检测平台制造技术

本文公开了用于采用纯多核苷酸聚合酶进行多核苷酸扩增的方法、组合物、设备、系统和试剂盒。在一些情况下，本文公开了用于多核苷酸测序的方法、组合物、设备、系统和试剂盒。

Gene testing platform

Methods, compositions, devices, systems, and kits for polynucleotide amplification using a pure polynucleotide polymerase are disclosed. In some cases, methods, compositions, devices, systems, and kits for polynucleotide sequencing are disclosed herein.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因检测平台交叉引用本申请要求于2014年9月2日提交的第62/044,872号美国临时申请的权益，该临时申请通过引用并入本文。对经由EFS-WEB提交的序列表的引用大小为26kb、文件名为“46681-702-601-seqlist_ST25.txt”的序列表ASCII文本文件的内容于2015年8月31创建，并经由EFS-Web以电子方式与本申请一同提交，其通过引用全文并入本文。专利技术背景基因扩增和基因测序近年来已引起广泛的关注。已经开发出各种基因扩增方法来促进这类扩增。通常，多核苷酸(如DNA)的扩增需要待扩增的多核苷酸链(靶多核苷酸)、含有与靶标互补的序列的短多核苷酸片段(即，引物)、核苷酸，以及使核苷酸以与靶多核苷酸互补的方式聚合(即共价连接)的酶。在化学反应期间，新延伸的多核苷酸链每并入一个核苷即释放一个焦磷酸分子。一种扩增反应为采用热稳定DNA聚合酶的多核苷酸链反应(PCR)。这类聚合酶的一个实例为最初从细菌水生栖热菌(Thermusaquaticus)中分离的Taq聚合酶。PCR依赖于热循环，该热循环由用于DNA解链和DNA酶促复制的反应的重复加热和冷却循环组成。以下过程需要热循环：(a)变性：双链多核苷酸分离成单链多核苷酸，该单链多核苷酸充当将会形成互补链的核苷酸的缔合的模板，其通常在94-98℃下发生；(b)退火：降低温度以允许引物与分离的多核苷酸链(即，ssDNA)发生氢键键合，其通常在50-65℃下发生；以及(c)延伸：允许酶促聚合的最佳条件，由此形成相对于模板多核苷酸的互补链，其通常在70-80℃下发生(取决于所用的具体聚合酶)。目前，由于扩增试剂中存在污染物(如来自宿主基因组物质和质粒的多核苷酸污染物)，因此基因检测的灵敏度有限。
技术实现思路
本文提供了用于制备多核苷酸样品以供其表达、扩增、测序或其任意组合的方法、组合物、试剂、装置、系统、试剂盒、程序、商业方法、报告和计算机软件。在一些方面，本专利技术公开了一种多核苷酸测序方法，其包括：(a)通过以下步骤复制至少一种靶多核苷酸：(i)使与所述至少一种靶多核苷酸的至少一部分互补的互补多核苷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交；(ii)使一种核苷多磷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交，其中该核苷选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；(iii)将所述一种核苷多磷酸与所述互补多核苷酸连接以延伸所述互补多核苷酸；(iv)释放至少一个焦磷酸；(b)将所述至少一个焦磷酸转化成ATP；(c)检测所述ATP；以及(d)通过使用糖磷酸化酶用过量的所述一种核苷多磷酸将至少一种糖磷酸化，而将所述过量的所述一种核苷多磷酸转化成核苷酸二磷酸或核苷酸单磷酸。在一些方面，本专利技术公开了一种多核苷酸测序方法，其包括：(a)通过以下步骤复制至少一种靶多核苷酸：(i)使与所述至少一种靶多核苷酸的至少一部分互补的互补多核苷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交；(ii)使一种核苷多磷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交，其中该核苷选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；(iii)将所述一种核苷多磷酸与所述互补多核苷酸连接以延伸所述互补多核苷酸；(iv)释放至少一个焦磷酸；(b)将所述至少一个焦磷酸转化成ATP；(c)检测所述ATP；以及(d)在不使用核苷降解酶的情况下将过量的所述一种核苷多磷酸灭活。在一些方面，本专利技术公开了一种多核苷酸测序方法，其包括：(a)通过以下步骤复制至少一种靶多核苷酸：(i)使与所述至少一种靶多核苷酸的至少一部分互补的互补多核苷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交；(ii)使一种核苷多磷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交，其中该核苷选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；(iii)将所述一种核苷多磷酸与所述互补多核苷酸连接以延伸所述互补多核苷酸；(iv)释放至少一个焦磷酸；(b)将所述至少一个焦磷酸转化成ATP；(c)检测所述ATP；以及(d)使用热稳定的酶将过量的所述一种核苷多磷酸灭活。在一些方面，本专利技术公开了一种多核苷酸测序方法，其包括：(a)通过以下步骤复制至少一种靶多核苷酸：(i)使与所述至少一种靶多核苷酸的至少一部分互补的互补多核苷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交；(ii)使一种核苷多磷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交，其中该核苷选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；其中所述一种核苷多磷酸不包含核苷多磷酸硫醇；(iii)将所述一种核苷多磷酸与所述互补多核苷酸连接以延伸所述互补多核苷酸；以及(iv)释放至少一个焦磷酸；(b)将所述至少一个焦磷酸转化成ATP；以及(c)检测所述ATP。在一些情况下，本专利技术公开了一种用于测量在多核苷酸复制过程中释放的焦磷酸的方法，其包括：(a)在反应混合物中进行多核苷酸复制，其中该复制导致至少一个焦磷酸的释放；(b)将所述焦磷酸转化成ATP；(c)向所述反应混合物中添加至少一种糖；以及(d)使用不识别dATP的萤光素酶检测所述ATP。在一些情况下，本专利技术还公开了一种用于测量在多核苷酸复制过程中释放的焦磷酸的方法，其包括：(a)在至少一种糖的存在下进行多核苷酸复制，其中该复制导致至少一个焦磷酸的释放；(b)将所述焦磷酸转化成ATP；以及(c)使用不识别dATP的萤光素酶检测所述ATP。在一些情况下，本专利技术进一步公开了一种用于监测糖磷酸化的速率的方法，其包括：(a)将糖磷酸化酶构建体与核苷多磷酸和至少一种糖反应，其中该糖磷酸化酶构建体包含白蛋白结合部分；以及(b)测量至少一种反应产物的量。在一些方面，本专利技术公开了与一种或多种本文公开的酶或蛋白质有关的构建体设计。在一些情况下，本专利技术公开了一种包含白蛋白结合部分的多核苷酸扩增酶构建体，其中该多核苷酸扩增酶在至少一种核苷多磷酸的存在下扩增靶多核苷酸。在一些情况下，本专利技术公开了一种包含对至少两种核苷多磷酸具有结合亲和力的至少一个部分的糖磷酸化酶构建体；其中所述对至少两种核苷多磷酸的结合亲和力在至少1微摩尔到至多250微摩尔(μM)的范围内；其中所述核苷选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；并且其中所述糖磷酸化酶构建体将至少一种糖磷酸化，以产生至少一种磷酸化的糖。在一些情况下，本专利技术公开了一种包含与白蛋白结合的至少一个部分的糖磷酸化酶构建体，其中该糖磷酸化酶构建体将至少一种糖磷酸化，以产生至少一种磷酸化的糖；其中该糖磷酸化酶构建体对白蛋白的解离常数为1.5纳摩尔或更低。在一些方面，本专利技术公开了包含糖磷酸化酶和至少一个白蛋白结合位点的糖磷酸化酶构建体。在一些方面，本专利技术还公开了包含生物发光酶和至少一个白蛋白结合位点的生物发光酶构建体。在一些方面，本专利技术公开了促进生物发光反应且不将dATP作为底物识别的生物发光酶。在一些方面，本专利技术公开了促进在高于50摄氏度的温度下的糖磷酸化反应的糖磷酸化酶。在一些方面，本专利技术公开了促进在高于50摄氏度的温度下的生物发光反应的生物发光酶。在一些方面，本专利技术公开了一种用于酶纯化的白蛋白亲和分离方法，其包括：(a)形成包含与白蛋白结合部分结合的靶酶的蛋白质构建体；(b)使所述蛋白质构建体与白蛋白接触以形成白蛋白分子复合物；(c)分离所述蛋白质构建体；以及(d)将所述蛋白质构建体从所述白蛋白分子复合物中取回，其中所述蛋白质构建体保留所述靶酶的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于测量在多核苷酸复制过程中释放的焦磷酸的方法，其包括：a.在反应混合物中进行多核苷酸复制，其中该复制导致至少一个焦磷酸的释放；b.将所述焦磷酸转化成ATP；c.向所述反应混合物中添加至少一种糖；以及d.使用对dATP的识别受损的热稳定萤光素酶检测所述ATP。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.02 US 62/044,8721.一种用于测量在多核苷酸复制过程中释放的焦磷酸的方法，其包括：a.在反应混合物中进行多核苷酸复制，其中该复制导致至少一个焦磷酸的释放；b.将所述焦磷酸转化成ATP；c.向所述反应混合物中添加至少一种糖；以及d.使用对dATP的识别受损的热稳定萤光素酶检测所述ATP。2.如权利要求1所述的方法，其中所述添加至少一种糖在所述多核苷酸复制之后。3.如权利要求2所述的方法，其中所述糖被磷酸化。4.如权利要求3所述的方法，其中所述糖的磷酸化消除过量的核苷酸。5.如权利要求4所述的方法，其中所述糖的磷酸化包括使用糖磷酸化酶。6.如权利要求1所述的方法，其中所述热稳定萤光素酶为热稳定的萤火虫萤光素酶。7.如权利要求1或6所述的方法，其中所述热稳定萤光素酶在与SEQIDNO:2的氨基酸残基T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530和L550相对应的一个或多个位置处包含修饰。8.如权利要求7所述的方法，其中所述修饰包括T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R和L550V。9.如权利要求8所述的方法，其中所述修饰包括T214A、I232A、F295L、I423L和L550V。10.如权利要求1所述的方法，其中所述热稳定萤光素酶的识别受损是对dATP的亲和力的降低。11.如权利要求1或6-10中任一项所述的方法，其中所述热稳定萤光素酶不识别dATP但识别ATP。12.如权利要求1或6-11中任一项所述的方法，其中所述热稳定萤光素酶进一步包含选自白蛋白结合蛋白或Z结构域的结合蛋白。13.如权利要求1所述的方法，其中所述转化在ATP硫酸化酶的存在下进行。14.如权利要求13所述的方法，其中所述ATP硫酸化酶是热稳定的。15.如权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸复制进一步包括以下步骤a.使与至少一种靶多核苷酸的至少一部分互补的互补多核苷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交；b.使一种核苷多磷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交，其中该核苷选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；以及c.将所述一种核苷多磷酸与所述互补多核苷酸连接以延伸所述互补多核苷酸。16.如权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸复制在高于50摄氏度的温度下进行。17.如权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸复制在至少50摄氏度、至少55摄氏度、至少60摄氏度、至少65摄氏度或至少70摄氏度的温度下进行。18.如权利要求1或15所述的方法，其中所述多核苷酸复制在聚合酶的存在下进行。19.如权利要求18所述的方法，其中所述聚合酶为Taq聚合酶。20.如权利要求19所述的方法，其中所述Taq聚合酶为天然Taq聚合酶、重组Taq聚合酶或经修饰的Taq聚合酶。21.如权利要求1所述的方法，其中该方法不包括单链结合蛋白(SSB)的使用。22.如权利要求5所述的方法，其中所述糖磷酸化酶为己糖激酶。23.如权利要求22所述的方法，其中所述己糖激酶为进一步包含选自白蛋白结合蛋白或Z结构域的结合蛋白的经修饰的己糖激酶。24.如权利要求22或23所述的方法，其中所述己糖激酶在酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或大肠杆菌中表达。25.如权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述己糖激酶为热稳定的己糖激酶。26.如权利要求12或23所述的方法，其中所述白蛋白结合蛋白包含ABP(121aa)、BB(214aa)、ABD(46aa)、ADB1结合位点、ADB2结合位点或ADB3结合位点。27.如权利要求26所述的方法，其中所述ABD对白蛋白的亲和力为1.5纳摩尔或更低。28.如权利要求27所述的方法，其中所述白蛋白为血清白蛋白。29.如权利要求27所述的方法，其中所述白蛋白为人血清白蛋白。30.如权利要求1、6-12或22-25中任一项所述的方法，其中所述己糖激酶、萤光素酶或ATP硫酸化酶被化学修饰。31.如权利要求30所述的方法，其中所述化学修饰的己糖激酶、萤光素酶或ATP硫酸化酶包括对所述己糖激酶、萤光素酶或硫酸化酶的碱性侧链的化学中和或化学酸化。32.如权利要求30所述的方法，其中所述化学修饰的己糖激酶、萤光素酶或ATP硫酸化酶包含乙酰化或柠康酰化。33.一种热稳定萤光素酶，其促进生物发光反应并且对作为底物的dATP的识别受损。34.如权利要求33所述的热稳定萤光素酶，其中该热稳定萤光素酶在与SEQIDNO:2的氨基酸残基T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530和L550相对应的一个或多个位置处包含修饰。35.如权利要求34所述的热稳定萤光素酶，其中所述修饰包括T214A、I232A、F295L、E354K...

【专利技术属性】
技术研发人员：纳德·努里扎德，
申请(专利权)人：菲尔莫兹姆公司，
类型：发明
国别省市：美国,US