使用能够穿透细胞质的完整免疫球蛋白类型的抗体抑制在细胞中活化的RAS的方法及其用途技术

本发明专利技术涉及通过使用具有穿透细胞质的能力和完整免疫球蛋白形式的抗体抑制在细胞中活化的RAS的方法。另外，本发明专利技术涉及以下重链可变区(VH)和包含所述重链可变区(VH)的抗体，所述重链可变区(VH)通过经由具有完整免疫球蛋白形式的抗体借助胞吞作用和内体逃逸而主动穿透活细胞的细胞质来诱导与在细胞质中活化的RAS结合。另外，本发明专利技术涉及通过使用所述抗体治疗癌症或肿瘤或抑制癌症或肿瘤细胞生长的方法。本发明专利技术还涉及筛选与细胞质中的RAS特异性结合的重链可变区的方法。本发明专利技术还涉及与所述抗体融合的生物活性分子。本发明专利技术还涉及用于预防、治疗或诊断癌症的组合物，其包含所述抗体或与所述抗体融合的生物活性分子。本发明专利技术还涉及编码所述轻链可变区和所述抗体的多核苷酸。

Methods for inhibiting the activation of RAS in cells using antibodies capable of penetrating the entire immunoglobulin type of the cytoplasm and uses thereof

The present invention relates to methods for inhibiting the activation of RAS in cells by using antibodies that have the ability to penetrate the cytoplasm and form a complete immunoglobulin form. In addition, the present invention relates to a heavy chain variable region (VH) and contains the heavy chain variable region (VH) antibody, the VH (VH) via antibody with complete immunoglobulin form by endocytosis and endosomal escape and active penetration of living cells and to induce cytoplasmic activation in the cytoplasm with RAS. In addition, the present invention relates to a method for treating cancer or tumor or inhibiting cancer or tumor cell growth by using said antibody. The present invention also relates to methods for screening heavy chain variable regions that are specifically bound to RAS in the cytoplasm. The present invention also relates to bioactive molecules fused with said antibodies. The invention also relates to a composition for preventing, treating or diagnosing cancer, comprising said antibodies or biologically active molecules fused with the antibodies. The present invention also relates to polynucleotides encoding the light chain variable region and the antibodies.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用能够穿透细胞质的完整免疫球蛋白类型的抗体抑制在细胞中活化的RAS的方法及其用途
本专利技术涉及使用能够穿透细胞溶胶的完整免疫球蛋白类型的抗体抑制细胞内活化的(GTP结合的)RAS的方法并涉及其用途。另外，本专利技术涉及诱导完整免疫球蛋白类型的抗体穿透细胞溶胶且与细胞溶胶中活化的RAS结合的重链可变区(VH)并涉及包含所述重链可变区(VH)的抗体。另外，本专利技术涉及使用所述抗体抑制癌症或肿瘤细胞生长的方法并涉及治疗癌症或肿瘤的方法。另外，本专利技术涉及筛选与细胞溶胶中的RAS特异性结合的重链可变区的方法。另外，本专利技术涉及与所述抗体融合且选自以下的生物活性分子：肽、蛋白、小分子药物、纳米粒和脂质体。另外，本专利技术涉及用于预防、治疗或诊断癌症的组合物，其包含：所述抗体；或与所述抗体融合且选自以下的生物活性分子：肽、蛋白、小分子药物、纳米粒和脂质体。另外，本专利技术涉及编码所述轻链可变区和所述抗体的多核苷酸。
技术介绍
完整免疫球蛋白类型的抗体具有高度稳定的Y形结构(分子量：150kDa)，其由两条重链(50kDa)蛋白和两条轻链(25kDa)蛋白组成。抗体轻链和重链分为可变区(其氨基酸序列在抗体间不同)和恒定区(其氨基酸序列在抗体间相同)。重链恒定区包括CH1、铰链、CH2和CH3结构域且轻链恒定区包含Cκ或Cλ结构域。抗体重链和轻链可变区具有氨基酸序列在抗体间特别不同的部分且这些部分构成抗原结合位点且因此也称为“互补决定区(CDR)”。当检查抗体的三维结构时，这些CDR形成抗体表面的环。环以下存在结构上支持环的框架区。在重链和轻链中，分别存在三个环结构且这六个环结构彼此组合且与抗原直接接触。抗体的重链恒定区(Fc)通过其与FcRn(新生Fc受体)的结合保证在血液中的长半衰期且由于该特征，与小分子药物不同的是，抗体在机体中可为持久的。另外，抗体与FcγR(Fcγ受体)等的结合使其可能特异性地通过抗体依赖的细胞的细胞毒性和补体依赖的细胞的细胞毒性诱导过表达靶物质的细胞的死亡。近来出于治疗多种疾病的目的已开发的许多产品可通过多种人源化的方法展现改善的治疗效果，如使用人抗体FR(框架)的CDR移植方法从而克服免疫原性。常规的抗体由于其大尺寸和亲水性而不能直接穿透活细胞。因此，最常规的抗体特异性靶向细胞外分泌蛋白或细胞膜蛋白(KimSJ等人,2005)。一般的抗体和大分子生物药物具有的局限在于其不能穿过疏水细胞膜且因此不能结合且抑制多种疾病相关物质。一般而言，在用于与机制如细胞生长、特异性抑制等有关的研究的实验中使用的特异性地与细胞内物质结合的商业抗体不能直接用于处理活细胞且为使这些抗体结合细胞内物质，通过细胞膜渗透方法使用两亲糖苷皂苷的在细胞膜中形成孔的预处理过程是必须的。小分子物质、核酸或纳米粒等可通过使用多种试剂或方法如电穿孔或热激转运到活细胞中，但由于上述的大多试剂和实验条件负面影响蛋白或抗体的特征三维结构，蛋白或抗体可丧失其活性。已开发了特异性地与细胞内蛋白结合且抑制其活性的细胞内抗体(胞内抗体)，但这些抗体还不具有穿透活细胞的膜的能力且因此仅可应用于基因疗法且其在未来的应用性非常有限(ManikandanJ等人,2007)。与多种类型的抗体片段包括如上文所述的完整免疫球蛋白类型的抗体、大分子物质如重组蛋白等不同的是，小分子物质由于其小尺寸和疏水性质容易且有效地穿透活细胞。然而，为使小分子药物与多种细胞中的疾病相关物质特异性结合，需要靶物质的表面具有疏水口袋。具有该疏水口袋的靶物质仅形成细胞中总的疾病相关物质的约10％且由于该原因，小分子药物不能特异性地靶向大多细胞中的致病性蛋白(ImaiK等人,2006)。在多种疾病包括癌症中，存在在细胞中的蛋白-蛋白相互作用(PPI)中发挥重要作用的蛋白或与转录或信号相关的多种蛋白的突变和异常过表达。这样的蛋白中，通过其大和平的表面显示复杂的相互作用的与疾病特别相关的物质难以特异性地通过如上文所述的小分子药物抑制(Blundell等人,2006)。例如RAS，其为细胞溶胶重要的肿瘤相关因子之一(目前尚不存在治疗剂)，作为通过细胞膜受体传输细胞外信号至细胞内信号系统的分子开关发挥作用。在约30％的人类癌症特别是结肠直肠癌和胰腺癌中，RAS在细胞中总是由于癌症相关突变活化且这样的致癌相关突变已知为赋予常规抗癌疗法强抗性的主要肿瘤相关因子(ScheffzekK等人,1997)。在克服目前的技术限制的尝试中，已实施多项研究以为可有效抑制蛋白-蛋白相互作用的抗体片段或大分子物质赋予细胞穿透能力。发现了具有碱性氨基酸序列和疏水或两亲性质的蛋白转导结构域(PTD)具有穿透活细胞的能力(LeenaN等人,2007)。另外，已作出许多尝试以使蛋白转导结构域与多种类型的抗体片段通过基因工程化方法融合从而识别特异性细胞内蛋白。然而，大多融合蛋白不从动物细胞分泌且仅以非常小的量释放到上清中(NaKajimaO等人,2004)且具有富集精氨酸的蛋白转导结构域的融合蛋白具有的问题是其在产生过程中弱抵抗宿主弗林蛋白酶(ChauhanA等人,2007)。另外，存在的问题是融合蛋白的细胞穿透效率低，使得难以将这些融合蛋白开发成为治疗性抗体(FalnesP等人,2001)。在克服表达相关问题的尝试中，已进行研究以在蛋白纯化后通过化学共价键或生物素-链霉亲和素键融合细胞穿透结构域，但这些方法导致蛋白的结构变形。另外，使用一些自身抗体实施的研究报导了抗体和短链可变区(scFv)抗体片段可通过胞吞作用穿透进入细胞。自身抗体是在具有自身免疫疾病的人和小鼠中发现的抗DNA抗体且这些抗体中的一些具有穿透活细胞的特征(MichaelR等人,1995；MichaelP等人,1996；JeskeZackD等人,1996)。至今报导的穿透细胞的自身抗体在其引入细胞后大多定位于核且已积极进行研究以将这些穿透细胞的自身抗体与在核中显示效应的特定蛋白融合(Weisbart等人,2012)。然而，蛋白通过使用自身抗体穿透进入活细胞具有的局限是蛋白最终定位于核且因此不能特异性地与胞内细胞溶胶中的多种疾病相关物质结合且抑制其活性。天然存在的大分子物质中，具有穿透细胞的性质的典型物质包括病毒(HIV、HSV)、毒素(霍乱毒素、白喉毒素)等。已知这些物质通过为细胞内活跃的转运机制的胞吞作用穿透细胞。该胞吞作用主要分为三种途径：通过由配体结合参与受体内化的网格蛋白的胞吞作用；在一些毒素如霍乱毒素中发现的通过小窝的胞吞作用；和在葡聚糖、埃博拉病毒等中发现的巨吞饮。其中网格蛋白和小窝参与的胞吞作用主要开始于当分布在细胞膜上的受体与特异性配体结合时。网格蛋白定位于细胞膜的内表面。当物质与受体结合时，网格蛋白使得纤维壳形成囊泡，其运动进入细胞。小窝通过小窝蛋白-1的作用形成低聚体同时形成运动进入细胞溶胶的稳定囊泡(小窝体)。在巨吞饮中，细胞膜的一部分突出以围绕物质由此形成运动进入细胞溶胶的大染色体(Gerber等人,2013)。其他内体逃逸机制不存在时，通过这样的胞吞作用通路穿透细胞溶胶的物质大多通过溶酶体通路降解。为避免通过溶酶体通路的降解，病毒、毒素等具有的机制是通过该机制其从内体逃逸进入细胞溶胶。尽管内体逃逸机制尚不清楚，至今已知三种内体逃本文档来自技高网...

【技术保护点】
抑制细胞内活化的RAS的方法，其使用能够穿透细胞溶胶的完整免疫球蛋白类型的抗体，其中所述抗体与所述细胞溶胶中活化的RAS特异性结合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.22 KR 10-2014-0092687;2015.07.21 KR 10-2011.抑制细胞内活化的RAS的方法，其使用能够穿透细胞溶胶的完整免疫球蛋白类型的抗体，其中所述抗体与所述细胞溶胶中活化的RAS特异性结合。2.权利要求1的方法，其中所述抗体为嵌合、人或人源化抗体。3.权利要求1的方法，其中所述抗体为选自以下的任何一种：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。4.权利要求1的方法，其中所述RAS是突变型。5.权利要求1的方法，其中所述抗体包含与所述细胞溶胶中活化的RAS特异性结合的重链可变区(VH)。6.权利要求5的方法，其中所述重链可变区(VH)包含：CDR1，其含有与选自以下的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列：SEQIDNO:8、11、14、17、20、23和26；CDR2，其含有与选自以下的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列：SEQIDNO:9、12、15、18、21、24和27；和CDR3，其含有与选自以下的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列：SEQIDNO:10、13、16、19、22、25和28。7.权利要求5的方法，其中所述重链可变区(VH)包含选自以下的氨基酸序列：SEQIDNO:1至7。8.权利要求1的方法，其中所述抗体为主动穿透活细胞的抗体。9.权利要求1的方法，其中所述抗体包含具有穿透所述细胞溶胶的能力的轻链可变区(VL)。10.权利要求9的方法，其中穿透所述细胞溶胶的能力为通过胞吞作用穿透细胞且然后通过内体逃逸定位在所述细胞溶胶中的能力。11.权利要求9的方法，其中所述轻链可变区包含：CDR1，其含有与选自以下的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列：SEQIDNO:32、35和38；和CDR3，其含有与选自以下的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列：SEQIDNO:34、27和40。12.权利要求9的方法，其中所述轻链可变区为以下轻链可变区，其中由所述轻链可变区的N末端开始编号的第2个和第4个氨基酸分别用亮氨酸(L)和甲硫氨酸(M)取代(其中所述氨基酸的位置根据Kabat编号系统进行编号)。13.权利要求9的方法，其中所述轻链可变区为以下轻链可变区，其中由所述轻链可变区的N末端开始编号的第9个、第10个、第13个、第15个、第17个、第19个、第21个、第22个、第42个、第45个、第58个、第60个、第79个和第85个氨基酸分别用丝氨酸(S)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、天冬氨酸(D)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、苏氨酸(T)、赖氨酸(K)、赖氨酸(K)、缬氨酸(V)、丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)和苏氨酸(T)取代(其中所述氨基酸的位置根据Kabat编号系统进行编号)。14.权利要求9的方法，其中所述轻链可变区为以下轻链可变区，其中由所述轻链可变区的N末端开始编号的第89个和第91个氨基酸分别用谷氨酰胺(Q)和酪氨酸(Y)取代(其中所述氨基酸的位置根据Kabat编号系统进行编号)。15.权利要求9的方法，其中所述轻链可变区包含选自以下的氨基酸序列：SEQIDNO:29、30和31。16.权利要求1的方法，其中所述抗体与所述细胞溶胶中活化的RAS的结合抑制活化的RAS与细胞溶胶中的B-Raf、C-Raf或PI3K的结合。17.一种重链可变区(VH)，其诱导完整免疫球蛋白类型的抗体穿透细胞溶胶且与所述细胞溶胶中活化的RAS结合。18.权利要求17的重链可变区(VH)，其中所述重链可变区(VH)包含：CDR1，其含有与选自以下的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列：SEQIDNO:8、11、14、17、20、23和26；CDR2，其含有与选自以下的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列：SEQIDNO:9、12、15、18、21、24和27；和CDR3，其含有与选自以下的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列：SEQIDNO:10、13...

【专利技术属性】
技术研发人员：金容星，崔东起，辛承敏，金圣勋，
申请(专利权)人：奥隆制药，
类型：发明
国别省市：韩国,KR