解折叠邻近探针及其使用方法技术

本发明专利技术涉及用于检测样品中分析物的基于邻位探针的检测分析，特别地涉及包括使用至少一组至少第一和第二邻近探针的方法，其中探针各自包含分析物‑结合域和核酸域且可以同时直接地或间接地结合分析物，其中至少一个所述邻近探针的核酸域包括发夹结构，该发夹结构可以通过裂解核酸域而解折叠产生至少一个可连接游离末端或与所述样品中另一个核酸分子互补的区域，其中当探针结合所述分析物时，解折叠所述发夹结构允许所述至少第一和第二邻近探针的核酸域直接地或间接地相互作用。

Folding proximity probe and method of use thereof

The invention relates to a method for detection of an analyte in a sample detection probe based on ortho analysis, particularly relates to a method including the use of at least one group of at least first and second adjacent to the probe, the probe of each analyte nucleic acid binding domain and domain and can also directly or indirectly with the analyte, wherein at least one domain of nucleic acid the adjacent probe includes a hairpin structure, the hairpin structure can be obtained by cleavage of nucleic acid domain unfolding generates at least one region can be connected with the free end or sample in another complementary nucleic acid molecules, which when the probe combined with the analyte, a direct interaction of nucleic acid folding the domain solution the hairpin structure allows the at least first and second adjacent probes or indirectly.

【技术实现步骤摘要】
解折叠邻近探针及其使用方法本申请是申请日为2012年5月11日、申请号为201280034685.0、专利技术名称为“解折叠邻近探针及其使用方法”的中国专利技术专利申请的分案申请。本专利技术涉及针对样品中的分析物的基于邻近探针的检测分析(“邻近分析”)，主要是邻近连接分析。本专利技术特别地涉及改进降低在复杂生物样品中出现的非特异性“背景”信号的方法，并简化所述分析。所述改进包括提供用于该测定的一个或多个修饰的“解折叠”邻近探针，其中一个或多个邻近探针的核酸域的至少部分“反应”或“功能”元件得到了保护(屏蔽或掩蔽)，避免了当与包括分析物的样品接触时其与其它核酸分子相互作用。解折叠的邻近探针的设计使得分析的至少一个邻近探针的核酸域包括一个或多个发夹环，从而使所述核酸域的反应(功能)元件的至少一部分避免与其它核酸分子相互作用。一旦邻近探针的分析物-结合域能够与分析物相互作用(即，同时结合分析物)，则由于“解折叠”发夹结构而可以从核酸域除去“保护”，能够使核酸域的反应元件与样品中的其它核酸域/分子以邻近依赖性方式相互作用。反应中至少一个邻近探针的核酸域的反应(功能)元件可以通过裂解反应解折叠，产生与所述样品中另一个核酸分子互补的至少一个游离末端或区域，其能够与样品中其它核酸域/分子相互作用。因此，在本专利技术中，解折叠邻近探针的作用是阻止加入到检测反应的探针彼此相互作用，尽管其具有互补序列元件，即能够相互作用的核酸域。因此，邻近探针能够与彼此独立的它们的靶分子(即分析物)相互作用，并且仅在解折叠之后，显示出核酸域的反应元件(例如，互补区域)且允许相互作用。解折叠机制也确保在反应期间出现邻近探针核酸域的“新”反应元件。其为能够参与连接或延伸反应的反应元件的“新”反应元件(即，之前被屏蔽的元件)，例如呈连接或扩增模板或者呈连接或延伸的核酸分子。解折叠机制也可以获得核酸分子之间，例如邻近探针的核酸域或样品中存在的其它分子之间的非特异相互作用(例如，错配)的数量减少。因此，可观察效应是分析的特异性、灵敏性和效率都由此增加。本专利技术还提供一些解折叠邻近探针和包括所述解折叠邻近探针的试剂盒，用于邻近分析，特别是邻近连接分析和邻近延伸分析。邻近分析依赖“邻近探测”的原理，其中通过同时结合多个(即两个或多个，通常两个、三个或四个)探针来检测分析物，所述的探针当通过结合分析物到达邻近(因此为“邻近探针”)时，使得信号生成。一般地，邻近探针中的至少一个包括连接于探针的分析物-结合域(或部分)的核酸域(或部分)，并且信号的生成涉及核酸部分和/或由其它探针携带的另外的功能部分之间的相互作用。因此，信号生成取决于探针之间(更具体地由它们携带的核酸或其它功能部分/域之间)的相互作用，因此仅当两个(或多个)必须的探针都结合于分析物时才出现，从而向检测系统提供改善的特异性。近年来发展了邻近探测的概念，现在基于该原则的许多分析在本领域是熟知的。例如，邻近连接分析(PLAs)依赖邻近探针与分析物的邻近结合，从而从连接反应产生信号，所述的连接反应涉及到邻近分析的核酸域或者由所述邻位分析的核酸域介导(例如，在其之间和/或通过其作为模板)。因此，在邻近分析中可以使用邻近探针，所述的邻近探针结合分析物并具有核酸域或部分，其在所述分析物结合后以邻近依赖性方式相互作用，通常导致连接至少一个、优选地两个或多个核酸分子，以形成可检测的、优选可扩增的核酸检测产物，可以借助所述核酸检测产物检测所述分析物。基于检测分析的邻近探针，特别是邻近连接分析通过将存在的该分析物转化为容易地可检测的或可定量的基于核酸的信号，从而允许灵敏地、快速地和便利地检测或定量样品中的一种或多种分析物，并且能够均质的或异质的形式进行。本领域的邻近探针通常成对地使用，并且分别由对靶分析物具有特异性的分析物-结合域和与其偶联的功能域构成，所述功能域例如为核酸连接域。所述分析物-结合域可以是例如核酸“适体”(Fredriksson等人(2002)NatBiotech20：473-477)或可以是蛋白质的，比如单克隆或多克隆抗体(Gullberg等人(2004)ProcNatlAcadSciUSA101：8420-8424)。每个邻近探针对的各自分析物-结合域可以对分析物上的不同结合位点具有特异性，所述分析物可以由单个分子或相互作用分子的复合物构成，或例如在靶分析物作为多聚体存在的情况下可以具有相同的特异性。当邻近探针对彼此紧密相邻时，这主要当两者结合于相同的分析物(其可以是相互作用分子的复合物)上的其各自的位点时发生，即当多个探针同时结合靶分析物时，功能域(例如核酸域)能够直接地或间接地相互作用。例如，核酸域通常可以通过连接反应结合形成新的核酸序列，其可以被加入反应中的夹板寡核苷酸作为模板，所述夹板寡核苷酸包含与邻近探针对的各自核酸域末端互补的区域。由此生成的新核酸序列用于报告样品中分析物的存在或量，并可以定性地或定量地检测，例如通过实时定量PCR(q-PCR)。可选地，当邻近时，邻近探针的核酸域可以在一个或多个加入的寡核苷酸(其可以是一个或多个邻近探针的核酸域)的相互连接时作为模板而不是彼此连接，所述的相互连接包括使加入的线性寡核苷酸成圆形的分子内连接，例如基于所谓的锁式探针原理，其中类似于锁式探针的是，加入的线性寡核苷酸的末端通过杂交至模板而并列，以进行连接，在本文中为邻近探针的核酸域(在锁式探针的情况下为探针的靶核酸)。各种这样的分析形式在WO01/61037中描述。WO97/00446和US6,511,809公开了邻近连接分析的不同形式，即首先借助特异性分析物结合试剂将分析物固定于固体基质。同质邻位连接分析(即，在溶液中的)公开在WO01/61037，WO03/044231，WO2005/123963，Fredriksson等人(2002)NatBiotech20：473-477和Gullberg等人(2004)ProcNatlAcadSciUSA101：8420-8424中。虽然通常使用邻近探针对，但是在例如WO01/61037和WO2005/12963中描述了邻近探针检测分析的修饰，其中使用三个邻近探针检测单个分析物分子，第三探针的核酸域具有两个游离末端，所述游离末端可以结合(连接)至第一和第二探针的核酸域各自游离末端，从而变成夹在其间。在该实施方案中，需要两种夹板寡核苷酸对第一和第二探针的每个核酸域与第三探针的核酸域的连接进行模板化。在WO2007/107743描述的一个进一步修饰中，为两个邻位探针的核酸域的连接作为模板的夹板寡核苷酸携带于第三邻位探针上。不是所有邻近分析均基于连接。WO2007/044903公开了用于检测分析物的基于邻近探针的分析，所述分析依赖于释放的核酸裂解产物的形成和检测。某些描述的实施方案涉及的探针包括分析物结合部分和连接的酶，所述酶作用于连接第二探针的分析物结合部分的核酸部分，使得释放可检测的核酸裂解产物。分析物检测分析，在某些实施方案中包括邻近探针样试剂，其中连接一个探针的分析物结合部分的聚合酶作用于连接第二探针的分析物结合部分的核酸部分，如在WO2009/012220中描述的。这些分析中，作为探针对的一个探针的部分的“锚定”聚合酶的作用导致游离在溶液中的模板的本文档来自技高网...

【技术保护点】
解折叠邻近探针，包括偶联核酸域的分析物‑结合域，其中所述核酸域包括：(i)至少一个与目标序列互补的区域；和(ii)自身互补的区域，使得其形成发夹结构，该发夹结构抑制所述至少一个互补区域杂交目标序列；其中所述发夹结构包括可裂解位点，且通过裂解所述位点解折叠该发夹结构获得部分双链核酸域，其包括游离5′和3′末端且能够使核酸域的所述至少一个互补区域杂交目标序列。

【技术特征摘要】
2011.05.11 GB 1107863.11.解折叠邻近探针，包括偶联核酸域的分析物-结合域，其中所述核酸域包括：(i)至少一个与目标序列互补的区域；和(ii)自身互补的区域，使得其形成发夹结构，该发夹结构抑制所述至少一个互补区域杂交目标序列；其中所述发夹结构包括可裂解位点，且通过裂解所述位点解折叠该发夹结构获得部分双链核酸域，其包括游离5′和3′末端且能够使核酸域的所述至少一个互补区域杂交目标序列。2.权利要求1所述的解折叠邻近探针，其中所述分析物-结合域与核酸不同。3.权利要求1或2所述的解折叠邻近探针，其中所述可裂解位点通过酶催化裂解。4.根据权利要求1-3中任一项所述的解折叠邻近探针，其中所述发夹结构包括能裂解核酸分子的一种或多种酶可识别的裂解识别位点。5.根据权利要求4所述解折叠邻近探针，其中所述裂解位点是切口酶或限制性核酸内切酶可识别位点。6.根据权利要求1至4中任一项所述的解折叠邻近探针，其中所述发夹结构包括一个或多个尿嘧啶残基。7.根据权利要求1至6中任一项所述的解折叠邻近探针，其中所述目标序列包括连接模板的一部分。8.根据权利要求7所述的解折叠邻近探针，其中所述连接模板是邻近探针的核酸域形式。9.根据权利要求7所述的解折叠邻近探针，其中所述连接模板是游离寡核苷酸。10.根据权利要求1至9中任一项所述的解折叠邻近探针，其中所述部分双链核酸域的游离5′和3′末端可以直接地或间接地连接形成环状寡核苷酸。11.根据权利要求1至9中任一项所述的解折...

【专利技术属性】
技术研发人员：乌尔夫·兰德格伦，瑞琪儿·元·农，欧拉·索德伯格，艾琳·魏贝雷希特，
申请(专利权)人：欧凌科公司，
类型：发明
国别省市：瑞典,SE