一种筛选中药神经活性成分的细胞膜固相色谱法及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种筛选中药神经活性成分的细胞膜固相色谱法及其应用，该方法包括如下步骤：通过液质联用建立待筛选中药苦参提取液指纹图谱；分离与培养背根神经节细胞；利用背根神经节细胞膜固相化结合筛选苦参提取液中的效应成分；洗脱未结合成分；解离并通过液质联用检测活性成分解离液成分。本发明专利技术用小鼠DRG细胞固相色谱技术作为抗瘙痒药物初筛的细胞模型，为筛选具有“止痒”作用的中药活性成分提供了新方法，具有良好的应用前景。

Cell membrane solid phase chromatography for screening nerve active ingredients of Chinese herbal medicine and application thereof

The invention discloses a nerve cell membrane screening of traditional Chinese medicine active ingredients of solid chromatography and its application, the method comprises the following steps: the liquid chromatography-mass spectrometry to establish screening Kushen extract fingerprint; isolation and culture of dorsal root ganglion cells; the dorsal root ganglion cell membrane immobilized with screening effect components of Sophora flavescens extract the elution; unbound components; dissociation by liquid chromatography-mass spectrometry detection of active ingredient dissociation solution composition. The present invention uses mouse DRG cell solid phase chromatography technique as a cell model for screening anti itch drugs, and provides a new method for screening active ingredients of traditional Chinese medicine with antipruritic effect, and has good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种筛选中药神经活性成分的细胞膜固相色谱法及其应用
本专利技术属于中药活性成分筛选及作用机制研究领域，特别涉及一种筛选中药神经活性成分的细胞膜固相色谱法及其应用。
技术介绍
传统细胞膜色谱(CellMembraneChromatography，CMC)首先需要制备细胞膜，再采用硅胶吸附的方法制备固定相，通常将固定相湿法装柱后以磷酸缓冲液为流动相，分析比较中药成分在色谱柱上的保留特性。细胞膜色谱力求尽量保持受体的“原位”性，模拟受体生存环境，使得药物分子与受体的相互作用更接近真实状态，研究细胞膜上的受体与配体的结合特性。细胞膜色谱同时也存在明显的不足，例如细胞受体的结合位点在细胞膜内外都存在，有分类方法将受体种类分为离子通道型、G-蛋白偶联型、酪氨酸激酶型以及细胞核内受体等，实际上还有细胞浆、细胞器内的各种酶等。细胞膜色谱研究中由于活细胞的破坏使得细胞内受体不复存在，因而失去了验证作用于这部分靶点的效应成分的机会。还有部分受体是由于另一些受体被激活后，通过活细胞的各种信号传导通路而被激活，这部分受体由于偶联作用需要活细胞的功能，其配体也不容易为细胞膜色谱所发现。此外该方法对流动相缓冲溶液的组成、pH值、柱温、柱压、流速等要求苛刻，难以最大限度保持细胞受体活性。通过细胞膜固相色谱(CellMembraneImmobilizedChromatography，CMIC)技术，将细胞与药液孵育使药液中活性成分与细胞膜表面受体结合，冲洗未吸附成分，再解离并检测吸附成分。省去了将细胞固定在硅胶这一步，既节约经费和时间，又有利于保持生物靶点的活性，是对CMC技术的一大创新和改进。目前已有研究人员利用多种生物材料如原代巨噬细胞，脾细胞，肺组织细胞成功用于三七、脉络宁等中药活性成分的辨识，显示出良好的应用前景。痒觉，尤其是慢性瘙痒的具体传导分子机制目前还不完全明确，且经常在多种疾病中作为并发症出现，据统计，美国特应性皮炎患者每年的医疗花费也已超过3亿美元。但目前慢性瘙痒的治疗不容乐观，由于各种慢性瘙痒的病理机制不同，现在市场上并没有可以有效治疗各种慢性瘙痒疾病的特效药或医疗措施。对于占比超过80％的慢性顽固性瘙痒，目前常见的止痒药往往疗效欠佳或有较严重副作用，例如临床上治疗瘙痒常用的抗过敏药、抗组胺药、糖皮质激素可能导致的精神萎靡、免疫紊乱等症状。因此阐明痒觉的产生与传导机制、筛选有抗瘙痒活性的物质对瘙痒的防治、抗瘙痒药物的开发极其重要。实验研究中可将痒觉分为组胺依赖型瘙痒(由致痒剂直接或者间接引起组胺释放而引起的瘙痒)与组胺非依赖型瘙痒(由不会引起组胺释放的致痒剂引起的瘙痒)，组胺依赖型瘙痒多为急性瘙痒例如荨麻疹、过敏引起的风团湿疹等可以通过服用组胺拮抗剂治疗；而组胺非依赖型瘙痒则多数为慢性顽固性的瘙痒，组胺拮抗剂通常疗效欠佳，例如特应性皮炎、接触性皮炎、银屑病等瘙痒。由于目前对组胺非依赖型瘙痒并无有效的疗法或药物，因此对组胺非依赖型瘙痒的机制研究是神经生物学领域一个极具挑战性的研究课题，而对其药物的开发也是目前皮肤病药物研究的一大热点。由于瘙痒是一种复杂的神经生理行为，因此抗瘙痒药物多数都是直接运用动物行为学来筛选，耗费大量时间与金钱，如何更为高效筛选抗瘙痒药物成为目前亟待解决的问题。随着神经科学的发展，对痒觉的研究逐渐深入，并发现了初级传入神经元上大量痒觉相关受体和免疫与痒觉的联系。本专利技术以此为基础用细胞筛选传统抗瘙痒中药苦参中的活性成分，并验证其活性成分的抗瘙痒效果。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种筛选中药神经活性成分的细胞膜固相色谱法。本专利技术的又一目的在于提供的所述细胞膜固相色谱法在中药神经活性成分筛选中的应用。本专利技术将生物学部分与化学部分分开进行，有利于保持靶点的活性，能发挥特异性结合和色谱分析各自的长处。本专利技术所建立的小鼠背根神经节细胞膜固相色谱法与液相质谱联用，对于多组分、多靶点的中药活性物质的筛选有很高的适用性；并通过后续的药效学实验方法验证活性成分药效。本专利技术采用小鼠的背根神经节(DRG)细胞建立固相色谱法模型，对传统抗瘙痒中药苦参的水提部位进行活性成分筛选及成分鉴定，通过对筛选出神经活性的成分进行药理学验证，确定了该方法的可行性，可用于其他抗瘙痒药物的活性成分筛选。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种筛选中药神经活性成分的细胞膜固相色谱法，通过小鼠背根神经节细胞膜固相化筛选中药提取液中的中药神经活性成分。所述的筛选中药神经活性成分的细胞膜固相色谱法，包括如下步骤：(1)通过高效液相色谱(HPLC)联用质谱建立待筛选中药提取液指纹图谱；(2)分离与培养小鼠背根神经节细胞；(3)小鼠背根神经节细胞膜固相化筛选中药提取液中的效应成分；(4)洗脱未结合成分，弃去洗脱液；(5)解离得到活性成分解离液；(6)将步骤(5)得到的活性成分解离液进行HPLC分析，通过比较活性成分解离液和步骤(1)得到的中药提取液指纹图谱中各吸收峰，确定与小鼠背根神经节细胞特异结合成分的特征峰，得到活性成分的特征峰，从而筛选得到中药神经活性成分。所述的中药优选为止痒中药和/或镇痛中药；进一步优选为苦参。所述的中药神经活性成分优选为抗顽固性瘙痒活性成分。所述的筛选中药神经活性成分的细胞膜固相色谱法，包括如下步骤：(1)通过高效液相色谱(HPLC)联用质谱建立待筛选中药苦参甲醇提取液指纹图谱；(2)分离与培养小鼠背根神经节细胞；(3)小鼠背根神经节细胞膜固相化筛选苦参水提取液中的效应成分；(4)洗脱未结合成分，弃去洗脱液；(5)解离得到活性成分解离液；(6)将步骤(5)得到的活性成分解离液进行HPLC分析，通过比较活性成分解离液和步骤(1)得到的苦参甲醇提取液指纹图谱中各吸收峰，确定与小鼠背根神经节细胞特异结合成分的特征峰，得到活性成分的特征峰，从而筛选得到中药神经活性成分。步骤(6)中所述的与小鼠背根神经节细胞特异结合成分的特征峰为1号峰、7号峰、8号峰、17号峰、19号峰五个特征峰，所述五个特征峰是与背根神经节细胞膜靶点结合的效应成分群。确定待筛选中药指纹图谱中各特征峰物质化学结构，所述1号峰物质为毛蕊异黄酮(Calycosin)、7号峰为氧化苦参碱(Oxymatrine)、8号峰为氧化槐果碱(Oxysophocarpine)、17号峰为高丽槐素(Maackiain)、19号峰为槐果碱(Sophocarpine)。所述的中药神经活性成分优选为抗顽固性瘙痒药物活性成分；进一步优选为毛蕊异黄酮(Calycosin)、氧化苦参碱(Oxymatrine)、氧化槐果碱(Oxysophocarpine)、高丽槐素(Maackiain)、槐果碱(Sophocarpine)。步骤(1)所述的通过高效液相色谱(HPLC)联用质谱建立待筛选中药苦参甲醇提取液指纹图谱的具体步骤包括：将苦参药材粉碎，过筛，将苦参粉末加入甲醇室温浸泡，离心取上清过0.22μm微孔滤膜，制得苦参甲醇提取液；通过液质联用确定苦参甲醇提取液中指纹峰与进行峰的指认。所述的浸泡的时间优选为8～16小时，进一步优选为12h。所述的苦参甲醇提取液的浓度优选为2～10g/L，进一步优选为5g/L。步骤(2)所述的分离小鼠背根神经节细胞的具体步骤包本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选中药神经活性成分的细胞膜固相色谱法，其特征在于：通过小鼠背根神经节细胞膜固相化筛选中药提取液中的中药神经活性成分。

【技术特征摘要】
1.一种筛选中药神经活性成分的细胞膜固相色谱法，其特征在于：通过小鼠背根神经节细胞膜固相化筛选中药提取液中的中药神经活性成分。2.根据权利要求1所述的筛选中药神经活性成分的细胞膜固相色谱法，其特征在于，包括如下步骤：(1)通过高效液相色谱(HPLC)联用质谱建立待筛选中药提取液指纹图谱；(2)分离与培养小鼠背根神经节细胞；(3)小鼠背根神经节细胞膜固相化筛选中药提取液中的效应成分；(4)洗脱未结合成分，弃去洗脱液；(5)解离得到活性成分解离液；(6)将步骤(5)得到的活性成分解离液进行HPLC分析，通过比较活性成分解离液和步骤(1)得到的中药提取液指纹图谱中各吸收峰，确定与小鼠背根神经节细胞特异结合成分的特征峰，得到活性成分的特征峰，从而筛选得到中药神经活性成分。3.根据权利要求2所述的筛选中药神经活性成分的细胞膜固相色谱法，其特征在于：所述的中药为止痒中药和/或镇痛中药。4.根据权利要求3所述的筛选中药神经活性成分的细胞膜固相色谱法，其特征在于：所述的中药为苦参。5.根据权利要求4所述的筛选中药神经活性成分的细胞膜固相色谱法，其特征在于，包括如下步骤：(1)通过高效液相色谱(HPLC)联用质谱建立待筛选中药苦参甲醇提取液指纹图谱；(2)分离与培养小鼠背根神经节细胞；(3)小鼠背根神经节细胞膜固相化筛选苦参水提取液中的效应成分；(4)洗脱未结合成分，弃去洗脱液；(5)解离得到活性成分解离液；(6)将步骤(5)得到的活性成分解离液进行HP...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂红，潘俭豪，徐晓云，汤丹，张喆，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44