一种用于检测金黄色葡萄球菌的LAMP检测用引物组及检测方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，涉及一种用于检测金黄色葡萄球菌的LAMP检测用引物组，LAMP检测引物组包括四条特异性引物，分别为正向内侧引物FIP:SEQ ID NO.1、反向内侧引物BIP:SEQ ID NO.2、正向外侧引物F3:SEQ ID NO.3和反向内侧引物B3:SEQ ID NO.4。检测方法包括：1、提取待测样品DNA；2、配制LAMP检测反应体系；3、以步骤1中提取的DNA为模版进行LAMP扩增反应，用实时浊度法鉴定扩增结果。本发明专利技术对金黄色葡萄球菌定性检测灵敏度可达到7.8CFU/mL(细菌浓度)，其灵敏度比普通PCR高10倍且反应结果易于观察。本发明专利技术设计的LAMP引物组和建立的金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、费用低廉等优点,可应用于基层实时、快速、准确的检测金黄色葡萄球菌。

Primer set for detecting LAMP of Staphylococcus aureus and detection method thereof

The invention belongs to the technical field of biological detection, which relates to a primer set for LAMP detection of Staphylococcus aureus, LAMP primer group includes four specific primers, respectively. FIP:SEQ ID forward inner primer NO.1, reverse primer BIP:SEQ ID NO.2 medial, lateral forward primer F3:SEQ NO.3 and ID the reverse primer B3:SEQ ID NO.4 inside. The detection methods include: 1. Extracting samples to be tested; DNA; 2, preparing LAMP detection reaction system; 3, using DNA extracted from step 1 as template, performing LAMP amplification reaction, and using real-time turbidimetric method to identify amplification results. The qualitative detection sensitivity of Staphylococcus aureus is up to 7.8CFU/mL (bacterial concentration), and the sensitivity is 10 times higher than that of common PCR, and the reaction result is easy to observe. LAMP detection method of the invention design LAMP primer pairs and the establishment of Staphylococcus aureus has the advantages of good specificity, high sensitivity, fast, low cost, and can be applied to the basic real-time, fast and accurate detection of Staphylococcus aureus.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测金黄色葡萄球菌的LAMP检测用引物组及检测方法
：本专利技术涉及生物检测
，特别涉及一种用于检测金黄色葡萄球菌的LAMP检测用引物组及检测方法。
技术介绍
：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一。它广泛分布在自然界中，如空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，因此食品受其污染的机会很多。在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33％；加拿大则更多，占到45％；我国每年发生的此类中毒事件也非常多。因此，建立一种快速、有效的检测方法对各种食品进行质量监督，及时检测出食品中是否含有该菌非常重要。目前金黄色葡萄球菌快速检测方法包括传统的细菌分离鉴定、免疫检测PCR方法等。细菌分离鉴定法操作繁琐、耗时长；免疫学方法如乳胶微粒凝集试验、ELISA等，可以缩短检测时间，但可能受到食物成分及葡萄球菌A蛋白的干扰；采用PCR方法可以快速、灵敏的从食品中检测金黄色葡萄球菌，但因PCR技术对模板DNA的质量有较高要求，需要的热循环设备价格昂贵而很难在基层得到推广。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是Notomi等人在2000年专利技术的一种新的恒温核酸扩增技术。传统的PCR技术离不开反复升降温这个耗时耗能的过程，且反应程序设定也较繁琐。相比之下LAMP技术克服了这些问题。根据LAMP技术的原理，它可实现在恒温条件下(一般在60～65℃)快速连续扩增，实现了实验过程快速、简便，仪器设备简单、便携，检测结果特异性强、灵敏度高的优点。LAMP扩增结果观察方式多，凝胶成像系统观察结果、肉眼观察颜色变化及试纸条技术，也可使用实时荧光法和实时浊度法，通过实时荧光PCR仪或实时浊度仪对扩增结果进行实时观察。
技术实现思路
：鉴于此，有必要设计一种检测快速、操作简便、特异性高、灵敏度好、成本低廉的检测金黄色葡萄球菌的LAMP检测用引物组，及利用该引物组检测金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法。一种用于检测金黄色葡萄球菌的LAMP检测用引物组，由内引物对FIP/BIP和外引物对F3/B3组成，FIP、BIP、F3、B3具体如下：一种利用前述引物组检测金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，包括以下步骤：步骤1、提取待测样品DNA；步骤2、配制LAMP检测反应体系，反应体系包括引物：SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4；步骤3、以步骤1中提取的DNA为模版进行LAMP扩增反应，用实时浊度法鉴定扩增结果。优选的，LAMP检测反应体系具体为：2×反应液RM12～13uL，FIP、BIP各3.7～4.3uL，F3、B3各0.4～0.6uL，BstDNA聚合酶0.9～1.2uL，待测样品DNA1.8～2.2uL，补超纯水至25uL。优选的，FIP、BIP的浓度是40umol/L，F3、B3的浓度是5umol/L。优选的，LAMP扩增反应的反应前的预热温度50.0℃，LAMP扩增反应的反应温度为63.0℃且进行40min，LAMP扩增反应的反应后的酶失活温度95℃进行2min。上述的LAMP检测方法中，检测结果通过实时浊度仪实时测量浊度值来判断核酸有无扩增。本专利技术采用上述技术方案，根据金黄色葡萄球菌转录调控基因sirB的序列，设计4条特异性LAMP引物，用来建立金黄色葡萄球菌LAMP检测方法。结果表明，建立的LAMP检测方法对金黄色葡萄球菌的检测特异性良好，且方法的灵敏度高。本专利技术方法不受培养条件的限制，可在50min内完成核酸的检测。本专利技术对金黄色葡萄球菌定性检测灵敏度可达到7.8CFU/mL，优于一般PCR检测方法，其检测灵敏度是普通PCR的10倍。附图说明：附图1是LAMP引物筛选试验图，NO.1-8分别为FemA-1引物组、FemA-2引物组、ebh引物组、rpiB-1引物组、rpiB-2引物组、SirB-1引物组、SirB-2引物组、空白对照。附图2是60℃时温度对LAMP反应的影响试验图。附图3是61℃时温度对LAMP反应的影响试验图。附图4是62℃时温度对LAMP反应的影响试验图。附图5是63℃时温度对LAMP反应的影响试验图。附图6是64℃时温度对LAMP反应的影响试验图。附图7是65℃时温度对LAMP反应的影响试验图。附图8是30min时时间对LAMP反应的影响试验图。附图9是40min时时间对LAMP反应的影响试验图。附图10是50min时时间对LAMP反应的影响试验图。附图11是60min时时间对LAMP反应的影响试验图。附图12是引物特异性鉴定试验图，NO.1-8依次为金黄色葡萄球菌标准株、金黄色葡萄球菌分离株DZJ-YS-003、金黄色葡萄球菌分离株DZJ-YS-004、鼠伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、鲍氏志贺氏菌、单增李斯特氏菌、空白对照。附图13是LAMP反应灵敏度试验图，NO.1-8分别是菌液浓度为7.8×107、106、105、104、103、102、10CFU/ml。附图14是普通PCR反应灵敏度试验图，M为DL1000Marker，泳道1-7分别是菌液浓度为7.8×107、106、105、104、103、102、10CFU/ml。具体实施方式：以下叙述中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。一、引物设计按照LAMP引物设计原则，根据GenBank数据库中的金黄色葡萄球菌特异基因组序列，进行多序列比对，寻找一段高度保守区作为扩增对象，然后设计7组引物，采用HPLC纯化方式。合成后的引物用超纯水稀释成100pmol/pL溶液，-20℃保存备用。各引物序列见表1。表1金黄色葡萄球菌的LAMP检测用引物二、金黄色葡萄球菌的LAMP检测标准方法的建立细菌基因组DNA快速抽提试剂盒为生工生物工程(上海)股份有限公司产品，LAMP扩增体系的2×反应液RM、BstDNA聚合酶为荣研生物科技(中国)有限公司产品。日本荣研LT-16alpha恒温扩增基因检测系统，ABIVeriti96WellThermalCycler核酸扩增仪、BioradGelDocXR凝胶成像系统。金黄色葡萄球菌实验用标准菌株购自中国工业微生物保存中心和北京路桥技术股份有限公司(见表2)。表2实验用菌种名称及编号1、样品DNA的提取样品为金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、鲍氏志贺氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌分离株DZJ-YS-003、金黄色葡萄球菌分离株DZJ-YS-004，共计5株标准菌株和2株金黄色葡萄球菌分离株的液体纯培养物。DNA的提取方法按照DNA提取试剂盒说明书中关于细菌DNA提取要求进行，具体步骤如下：(1)吸取1mL过夜培养的细菌菌液，加入1.5mL离心管中，室温8000rpm离心1min，弃上清，收集菌体。加入400uLBufferDigestion，震荡混匀。65℃水浴1h至细胞完全裂解。(2)加入200uLBufferPB，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。(3)室温10000rpm离心5min，将上清液转移到新的1.5mL离心管本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测金黄色葡萄球菌的LAMP检测用引物组，其特征在于，由内引物对FIP/BIP和外引物对F3/B3组成，FIP、BIP、F3、B3具体如下：

【技术特征摘要】
1.一种用于检测金黄色葡萄球菌的LAMP检测用引物组，其特征在于，由内引物对FIP/BIP和外引物对F3/B3组成，FIP、BIP、F3、B3具体如下：2.一种利用权利要求1所述的引物组检测金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、提取待测样品DNA；步骤2、配制LAMP检测反应体系，反应体系包括引物：SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4；步骤3、以步骤1中提取的DNA为模版进行LAMP扩增反应，用实时浊度法鉴定扩增结果。3.如权利要求2所述的一种利用权利要求1所述的引物组检测金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，其特征在于，LAMP检测反应体系具体为：...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝俊虎，贺生芳，李婧，孙敏，邹明强，
申请(专利权)人：宁夏出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心，中检国研北京科技有限公司，
类型：发明
国别省市：宁夏,64