检测MPL基因全外显子的试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了检测MPL基因全外显子的方法和试剂盒，所述引物、试剂盒包括扩增覆盖MPL基因全外显子序列的8对正、反向引物，所述PCR扩增的上游引物5’端和下游引物5’端分别加了长18bp的M13‑F引物序列和长16bp的M13‑R引物序列。基于采用Sanger测序法，利用一对通用引物M13作为测序引物，检测MPL基因全外显子序列的突变情况。可应用于先天性无巨核细胞性血小板减少患者的基因诊断方面。

Kit and method for detecting MPL gene full exon

Method and kit of the present invention discloses full detection of MPL gene exon, the primers, including amplification kit covering MPL gene all exons of the 8 sequences of the forward and reverse primers, M13 R primer sequence the upstream primer PCR amplification of the 5 'end and 5' end respectively with the downstream primer the 18bp M13 F primer sequences and the length of 16bp. Based on Sanger sequencing, a pair of universal primers M13 were used as sequencing primers to detect mutations in the entire exon sequence of the MPL gene. The utility model can be applied to the gene diagnosis of congenital non nucleated thrombocytopenia patients.

【技术实现步骤摘要】
检测MPL基因全外显子的试剂盒和方法
本专利技术属医学生物
，特别涉及检测MPL基因全外显子突变的试剂盒、引物和方法
技术介绍
无巨核细胞性血小板减少可分为先天性和获得性两种，先天性无巨核细胞性血小板减少(CAMT)是新生儿的一种少见病，伴有多种先天性异常，畸形及再生障碍性贫血。新生儿期发病，皮肤可见紫癜、瘀斑。50％有先天性畸形，小头、发育迟缓、小脑及脑萎缩、先天性心脏病(房室间隔缺损、动脉导管未闭、法洛四联症、主动脉缩窄)，其他如兔唇或高弓形腭、肾、眼、足异常。人类c-mpl基因(MPL)在巨核细胞和血小板的生长发育及造血干细胞的自我更新中都起到重要作用，然而，在造血系统疾病中，检测到很多的MPL基因突变，这些突变改变了正常的调控机制，并导致自主性激活或信号传导缺陷。自从1999年，在先天性无巨核细胞性血小板减少(CAMT)患者中检测到第一例MPL突变，在原发性血小板增多症(HT)、骨髓增生性肿瘤(MPNS)，伴环形铁粒幼细胞与血小板显著相关的难治性贫血((RARS-t))，急性髓系白血病(AML)都已检测到MPL基因突变。MPL(myeloproliferativeleukaemiavirusoncogene)位于人染色体lp34，包括12个外显子，并编码人血小板生成素受体。与CAMT疾病相关的MPL基因突变是常染色体，隐形基因突变，在疾病的发生中起到决定性作用。根据ballmaier等人收集的数据显示，61例CAMT患者进行MPL基因突变检测，56例检测出MPL基因突变，突变率高达91.8％。据文献报道，在CAMT患者中发现了41种不同的MPL基因突变，包括无义突变、缺失突变和移码突变，错义突变和剪接位点突变等。多种基因突变检测技术包括蛋白截断试验(PTT)、单链构象多态性(SSCP)、异源双链分析(HA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)等方法。但所有这些方法均有一定的局限性,从而限制了基因突变的检出率。目前常用的基因突变检测的方法是基因测序和荧光定量PCR等。由于MPL容量大、突变类型多、突变位点散在分布，故而阻止了对MPL基因突变的深入研究，荧光定量PCR法并不适用。
技术实现思路
本专利技术提供检测MPL基因全外显子的引物，采用Sanger测序法，可用于快速检测MPL基因全外显子突变的情况，用于MPL的基因诊断。本专利技术的目的在于提供检测MPL基因全外显子的引物，包括：扩增覆盖检测MPL基因全外显子突变的8对正、反向引物；其碱基序列分别是：MPL-1-2F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGAAGGGAGGATGGGCTAMPL-1-2R:AACAGCTATGACCATGGCAGGGACAGATACATGGGGAMPL-3F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCATGGTGGCTGTGTAGGAGMPL-3R:AACAGCTATGACCATGAAGTCTGATTCCGGGAGCTGGACMPL-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGACTGTGGTACTCAGAGTTMPL-4R：AACAGCTATGACCATGGGGCAAGATTGAAGGTAGGAGMPL-5-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTAGATTGTGAAGCTGGGATMPL-5-6R：AACAGCTATGACCATGCACTCCCATGACACCAACCTCMPL-7-8F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGGGATTAGTCTCTGGGGCAMPL-7-8R：AACAGCTATGACCATGTCCCCTGCGTAGTGAGGTCTGMPL-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTTTGTGGGAATCTCCGACCGMPL-9R：AACAGCTATGACCATGCAGGCGCTGTGCGGCTTTGGTGCMPL-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTAGGGGCTGGCTGGATGAGMPL-10R：AACAGCTATGACCATGCGGAGATCTGGGGTCACAGAGMPL-11-12F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCCTCCCTGCCAATCCACTGMPL-11-12R：AACAGCTATGACCATGTAGGGAAGTTCACAGAGAAGT。进一步地，所述8对正、反向引物的使用浓度比为：MPL-1-2F:MPL-1-2R＝1:1；MPL-3F:MPL-3R＝1:1；MPL-4F:MPL-4R＝1:1；MPL-5-6F:MPL-5-6R＝1:1；MPL-7-8F:MPL-7-8R＝1:1；MPL-9F:MPL-9R＝1:1；MPL-10F:MPL-10R＝1:1；MPL-11-12F:MPL-11-12R＝1:1。进一步的，还包括测序引物M12-F和M12-R：M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13-R：AACAGCTATGACCATG。本专利技术的目的还在于提供一种检测MPL基因全外显子的方法，其包括如下步骤：(1)提取样品DNA；(2)利用8对扩增引物MPL-1-2F与MPL-1-2R；MPL-3F与MPL-3R；MPL-4F与MPL-4R；MPL-5-6F与MPL-5-6R；MPL-7-8F与MPL-7-8R；MPL-9F与MPL-9R；MPL-10F与MPL-10R；MPL-11-12F与MPL-11-12R，对(1)中的DNA进行扩增，获得覆盖检测MPL基因全外显子序列的扩增产物；(3)利用1对测序引物M13-F与M13-R对(2)中的扩增产物进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；(4)将(3)中的基因序列与野生型MPL基因序列进行比较，确定突变位点是否存在；其中所述引物序列为：MPL-1-2F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGAAGGGAGGATGGGCTAMPL-1-2R:AACAGCTATGACCATGGCAGGGACAGATACATGGGGAMPL-3F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCATGGTGGCTGTGTAGGAGMPL-3R:AACAGCTATGACCATGAAGTCTGATTCCGGGAGCTGGACMPL-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGACTGTGGTACTCAGAGTTMPL-4R：AACAGCTATGACCATGGGGCAAGATTGAAGGTAGGAGMPL-5-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTAGATTGTGAAGCTGGGATMPL-5-6R：AACAGCTATGACCATGCACTCCCATGACACCAACCTCMPL-7-8F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGGGATTAGTCTCTGGGGCAMPL-7-8R：AACAGCTATGACCATGTCCCCTGCGTAGTGAGGTCTGMPL-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTTTGTGGGAATCTCCGACCGMPL-9R：AACAGCTATGACCATGCAGGCGCTGTGCGGCTTTGGTGCMPL-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTAGGGGCTGGCTG本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测检测MPL基因全外显子的试剂盒，其特征在于，包括：扩增覆盖检测MPL基因全外显子的正、反向引物；其碱基序列为：MPL‑1‑2F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGAAGGGAGGATGGGCTAMPL‑1‑2R:AACAGCTATGACCATGGCAGGGACAGATACATGGGGAMPL‑3F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCATGGTGGCTGTGTAGGAGMPL‑3R:AACAGCTATGACCATGAAGTCTGATTCCGGGAGCTGGACMPL‑4F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGACTGTGGTACTCAGAGTTMPL‑4R：AACAGCTATGACCATGGGGCAAGATTGAAGGTAGGAGMPL‑5‑6F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTAGATTGTGAAGCTGGGATMPL‑5‑6R：AACAGCTATGACCATGCACTCCCATGACACCAACCTCMPL‑7‑8F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGGGATTAGTCTCTGGGGCAMPL‑7‑8R：AACAGCTATGACCATGTCCCCTGCGTAGTGAGGTCTGMPL‑9F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTTTGTGGGAATCTCCGACCGMPL‑9R：AACAGCTATGACCATGCAGGCGCTGTGCGGCTTTGGTGCMPL‑10F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTAGGGGCTGGCTGGATGAGMPL‑10R：AACAGCTATGACCATGCGGAGATCTGGGGTCACAGAGMPL‑11‑12F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCCTCCCTGCCAATCCACTGMPL‑11‑12R：AACAGCTATGACCATGTAGGGAAGTTCACAGAGAAGT。...

【技术特征摘要】
1.检测检测MPL基因全外显子的试剂盒，其特征在于，包括：扩增覆盖检测MPL基因全外显子的正、反向引物；其碱基序列为：MPL-1-2F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGAAGGGAGGATGGGCTAMPL-1-2R:AACAGCTATGACCATGGCAGGGACAGATACATGGGGAMPL-3F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCATGGTGGCTGTGTAGGAGMPL-3R:AACAGCTATGACCATGAAGTCTGATTCCGGGAGCTGGACMPL-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGACTGTGGTACTCAGAGTTMPL-4R：AACAGCTATGACCATGGGGCAAGATTGAAGGTAGGAGMPL-5-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTAGATTGTGAAGCTGGGATMPL-5-6R：AACAGCTATGACCATGCACTCCCATGACACCAACCTCMPL-7-8F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGGGATTAGTCTCTGGGGCAMPL-7-8R：AACAGCTATGACCATGTCCCCTGCGTAGTGAGGTCTGMPL-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTTTGTGGGAATCTCCGACCGMPL-9R：AACAGCTATGACCATGCAGGCGCTGTGCGGCTTTGGTGCMPL-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTAGGGGCTGGCTGGATGAGMPL-10R：AACAGCTATGACCATGCGGAGATCTGGGGTCACAGAGMPL-11-12F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCCTCCCTGCCAATCCACTGMPL-11-12R：AACAGCTATGACCATGTAGGGAAGTTCACAGAGAAGT。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述8对正、反向引物的使用浓度比为：MPL-F:MPL-R＝1:1。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括测序引物，其序列为：M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13-R：AACAGCTATGACCATG。4.一种检测检测MPL基因全外显子序列的方法，其包括如下步骤：(1)提取样品DNA；(2)利用8对扩增引物MPL-1-2F与MPL-1-2R；MPL-3F与MPL-3R；MPL-4F与MPL-4R；MPL-5-6F...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文静，吴鹏飞，王淑一，
申请(专利权)人：武汉艾迪康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42