一种检测结直肠癌血清分泌型lncRNAs的引物和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测结直肠癌血清分泌型lncRNAs的引物和试剂盒，所述引物包括：一对outer引物和一对inner引物；所述outer引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；所述inner引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。本发明专利技术采用的巢氏实时定量PCR对结直肠癌血清分泌型lncRNA Loc100130899进行检测，巢氏实时定量PCR扩增为两次PCR扩增反应过程，第一阶段的PCR反应是对原始cDNA模板进行扩增，避免了血清分泌型RNA丰度较低的问题，使得痕量RNA即可被扩增检测到，大大提高了检测的灵敏度。

A primer and kit for detecting serum secretory lncRNAs in colorectal cancer

The invention discloses a method for detecting colorectal cancer serum secreted lncRNAs primer and kit, the primers include: a pair of outer primers and a pair of inner primers; the nucleotide sequence of outer primers is shown as SEQ ID and SEQ No.1 ID No.2; nucleotide sequence of the primers of inner as SEQ ID and SEQ No.3 ID No.4. Nested real-time quantitative PCR the secretory lncRNA Loc100130899 to detect colorectal cancer serum, nested real-time quantitative PCR amplification reaction process of two PCR PCR, the first phase of the reaction is the original cDNA template for amplification, to avoid the serum secretory RNA abundance low, the trace RNA can be detected by amplification, which greatly improves the detection sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
一种检测结直肠癌血清分泌型lncRNAs的引物和试剂盒
本专利技术涉及分子生物学检测
，具体涉及一种检测结直肠癌血清分泌型lncRNAs的引物和试剂盒。
技术介绍
结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发生率和死亡率均居男、女恶性肿瘤的第三位，严重威胁人类健康。结直肠癌的发生是一个涉及遗传学、表观遗传学异常的复杂过程，虽然经过长期研究，至今仍未能建立易于推广的有效诊断手段，导致大部分患者就诊时己处于中晚期，丧失了治愈的最佳时机。目前可用于结直肠癌早期诊断的手段非常有限，如结直肠镜检查、粪便隐血实验、影像学检查、血肿瘤标志物检测等，因依从性差、敏感性和/或特异性不高等原因，临床应用还存在不足。因此，寻找并鉴定与结直肠癌发生相关的新型分子标志物用于结直肠癌的早期诊断仍是目前临床关注的焦点。长链非编码RNAs(lncRNAs)参与调控肿瘤细胞内多种生物学过程，在肿瘤发生、发展中发挥着重要作用，并且在不同肿瘤中存在各自的表达模式，有望成为一类重要的肿瘤标志物。近年研究显示，lncRNAs可通过转录调控、染色质修饰、X染色体沉默、核内运输等多种重要的调控作用，参与肿瘤的发生、发展。Ling等研究发现，lncRNACCAT2在微卫星稳定的结直肠癌组织中呈过表达，能够促进肿瘤细胞的生长、转移和染色质不稳定(Ling,H.etal(2013)Genomeresearch,23:1446-1461)。Takahashi等发现lncRNAPVT-1可通过抑制TGF-β信号通路和凋亡信号来促进结直肠癌的发生发展，是预测结直肠癌预后的一项良好指标(Takahashi,Y.etal(2014)Britishjournalofcancer,110:164-171)。Ji等研究发现，lncRNAMALAT1能够激活结直肠癌细胞中的Wnt/β-catenin信号途径，从而促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭(Ji,Q.etal(2013)PloSone,8:e78700)。Nissan等采用代表性差异分析法发现了一种与结直肠癌密切相关的lncRNA——CCAT1，进一步研究显示CCAT1在结直肠癌发生的早期阶段就明显升高，有望成为一种潜在的结直肠癌早期诊断标志物(Nissan,A.etal(2012)Internationaljournalofcancer,130:1598-1606)。近年来关于lncRNAs的研究进展迅猛，各类lncRNAs被大量发现，大部分临床研究主要集中在结直肠癌组织，如何利用无创性诊断手段对lncRNAs进行分析，已成为肿瘤诊断领域关注的焦点。近年来，外泌体(exosomes)的出现成为液态活检的主要检测物，为肿瘤的无创检测提供了一条新的途径。目前实时荧光定量PCR方法是检测lncRNAs的主要方法，但由于血清外泌体中lncRNAs的丰度较低，临床应用易出现假阴性，因此有必要开发一种敏感性高的血清分泌型lncRNAs的检测方法，为结直肠癌的早期发现提供帮助。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种检测结直肠癌血清分泌型lncRNAs的引物和试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供血清分泌型lncRNALoc100130899作为结直肠癌诊断标志物在制备结直肠癌诊断试剂中的用途。所述血清分泌型lncRNALoc100130899是GeneBank数据库上报的核苷酸序列NR_039988.1。进一步的，本专利技术还提供检测血清分泌型lncRNALoc100130899的试剂在制备结直肠癌诊断试剂中的用途。本专利技术的第二方面，提供一种检测上述血清分泌型lncRNALoc100130899的引物。本专利技术的引物包括：一对outer引物和一对inner引物；所述outer引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示；所述inner引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示。具体如下：outer-F：5’-AGAACAGGCAGTATGTCCGC-3’；(SEQIDNo.1)outer-R：5’-AAGCCACTGGAGGTCACAAC-3’；(SEQIDNo.2)inner-F：5’-AGTGCTGTGGGTACAAGCAA-3’；(SEQIDNo.3)inner-R：5’-CCCAGCAAATATCCACCGGA-3’；(SEQIDNo.4)上述的引物在制备检测结直肠癌的试剂和/或试剂盒中的应用也是本专利技术的保护范围。本专利技术的第三方面，提供一种检测结直肠癌的试剂盒，所述试剂盒中包括：SEQIDNo.1、SEQIDNo.2所示的outer引物，和SEQIDNo.3、SEQIDNo.4所示的inner引物。所述试剂盒中还包括：内参基因GAPDH的一对outer引物和一对inner引物，内参基因UBC的一对outer引物和一对inner引物，以及PCR反应液和qPCR反应液；所述内参基因GAPDH的outer引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示；内参基因GAPDH的inner引物的核苷酸序列如SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示；所述内参基因UBC的outer引物的核苷酸序列如SEQIDNo.9和SEQIDNo.10所示；内参基因UBC的inner引物的核苷酸序列如SEQIDNo.11和SEQIDNo.12所示。优选的，所述PCR反应液由DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成。优选的，所述qPCR反应液由SyberGreenⅠ荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成。优选的，上述试剂盒中，SEQIDNo.1-SEQIDNo.12所示引物的浓度均为10nM；DNA聚合酶的浓度为100U/mL；dNTPs的浓度为0.2mM；氯化镁的浓度为6mM；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为16.5mM；氯化钾的浓度为89.3mM。上述引物或试剂盒在定性或定量检测血清分泌型lncRNALoc100130899表达量中的应用也是本专利技术的保护范围。本专利技术的第四方面，提供一种检测结直肠癌血清分泌型lncRNALoc100130899表达量的方法，包括如下步骤：(1)提取血清分泌型RNAs；(2)采用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA；(3)以cDNA为模板进行巢氏实时定量PCR扩增；同时将内参基因GAPDH、UBC进行逆转录巢氏实时定量PCR扩增；(4)采用2-△△Cq法计算lncRNALoc100130899的相对表达量。步骤(1)中，提取血清分泌型RNAs采用的方法为：将血清与ExoQuickTMExosomePrecipitationSolution试剂混匀，室温静置；然后离心，弃上清，加入trizol试剂混匀，室温静置，加入氯仿，剧烈震荡，室温静置，离心，取上清加入异丙醇，室温静置，离心，弃上清，加入75％乙醇洗涤，离心，弃上清，加DEPC水溶解备用。步骤(2)中，逆转录的条件为：37℃15min、85℃5s。步骤(3)中，以cDNA为模板进行巢氏实时定量PCR扩增包括两阶段PCR反应，第一阶段PCR反应：以cDNA为模板，以SEQIDNo.1、SEQIDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
血清分泌型lncRNA Loc100130899作为结直肠癌诊断标志物在制备结直肠癌诊断试剂中的用途。

【技术特征摘要】
1.血清分泌型lncRNALoc100130899作为结直肠癌诊断标志物在制备结直肠癌诊断试剂中的用途。2.检测血清分泌型lncRNALoc100130899的试剂在制备结直肠癌诊断试剂中的用途。3.一种检测血清分泌型lncRNALoc100130899的引物，其特征在于，所述引物包括：一对outer引物和一对inner引物；所述outer引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示；所述inner引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示。4.权利要求3所述的引物在制备检测结直肠癌的试剂和/或试剂盒中的应用。5.一种检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：SEQIDNo.1、SEQIDNo.2所示的outer引物，和SEQIDNo.3、SEQIDNo.4所示的inner引物。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：内参基因GAPDH的一对outer引物和一对inner引物，内参基因UBC的一对outer引物和一对inner引物，以及PCR反应液和qPCR反应液；所述内参基因GAPDH的outer引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示；内参基因GAPDH的inner引物的核苷酸序列如SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示；所述内参基因UBC的outer引物的核苷酸序列如SEQIDNo.9和SEQIDNo.10所示；内参基因UBC的inne...

【专利技术属性】
技术研发人员：张欣，张艳丽，李晨，张义，王传新，
申请(专利权)人：山东大学齐鲁医院，
类型：发明
国别省市：山东,37