采用锌指核酸酶技术破坏人bcr‑abl融合基因以抑制CML细胞增殖和促使其凋亡制造技术

本发明专利技术公开了一种DNA分子，其序列如SEQ ID No:2所示，还公开了该DNA分子作为靶点在抑制人bcr‑abl融合基因表达或导致人bcr‑abl基因功能丧失中的应用；抑制人bcr‑abl基因表达或导致人bcr‑abl基因功能丧失是由锌指核酸酶介导的bcr‑abl融合基因同源重组技术带来的。本发明专利技术针对bcr‑abl序列中特异的靶序列位点构建的ZFN质粒可高效靶向bcr‑abl基因发生DNA双链断裂，以HDR方式进行修复使bcr‑abl发生移码等突变而被破坏，从而丧失促增殖、抑凋亡等恶性转化潜能，证实ZFNs靶向破坏bcr‑abl基因杀伤和抑制CML细胞的可行性。

The zinc finger nuclease technology fusion gene of human BCR ABL failure to inhibit the proliferation of CML cells and promote its apoptosis

The invention discloses a DNA molecule, the sequence of SEQ ID No:2 shows, and also discloses the DNA molecule as a target caused by the loss of BCR abl gene function in inhibiting BCR abl fusion gene expression or inhibition of human BCR; expression of abl gene in BCR or ABL for the loss of function is composed of a zinc finger nuclease mediated BCR abl fusion gene homologous recombination technology brings. The invention of ZFN plasmid target sequence specific BCR ABL sequence you point in building efficient targeting BCR abl gene DNA double strand breaks in HDR repair BCR ABL frameshift mutation, which was destroyed, thus losing the proliferation and anti apoptosis of malignant transformation potential, confirmed ZFNs targeting abl gene damage BCR cytotoxicity and inhibition of CML cells.

【技术实现步骤摘要】
采用锌指核酸酶技术破坏人bcr-abl融合基因以抑制CML细胞增殖和促使其凋亡
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种采用锌指核酸酶技术破坏人bcr-abl融合基因以抑制CML细胞增殖和促使其凋亡。
技术介绍
慢性粒细胞白血病(Chronicmyeloidleukemia,CML)的致病根源是由于t(9；22)(q34；q11)平衡易位导致c-abl基因与bcr基因形成bcr-abl融合基因。该融合基因编码的BCR-ABL融合蛋白具有强烈的酪氨酸激酶活性，持续激活下游的RAS/MAPK，PI3K/AKT，STAT5等促增殖抑凋亡信号，导致细胞的恶性转化。临床上的一线治疗药物伊马替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosinekinaseinhibitors，TKIs)，可以使近70％的CML慢性期患者达到血液学甚至遗传学的完全缓解，但是，另外30％的患者由于BCR-ABL激酶区突变引发耐药，尤其是T315I突变，即使是新开发的第二代酪氨酸激酶抑制剂，也束手无策；并且，酪氨酸激酶抑制剂只能抑制Abl激酶活性，不能使bcr-abl基因转为阴性，特别是白血病干细胞(leukemiastemcell,LSC)对TKIs不敏感，残留的LSC成为复发的根源。因此，探索新的根治CML的方法迫在眉睫。细胞本身存在一种DNA损伤-修复机制，当DNA双链的一条链断裂后，以另外一条链为模板进行同源修复；当DNA双链的两条链均断裂后，以同源染色体的DNA双链为模板进行同源修复，从而确保基因组的稳定。当两条染色体的DNA双链均断裂后，以非同源末端连接(nonhomologousendjoining,NHEJ)的方式进行修复，这种修复方式极易发生插入、缺失致移码突变。利用细胞的这种损伤-修复原理，诞生了一种可以定点操作基因组的核酸酶修饰技术。它由特异性的DNA识别结合结构域和非特异性剪切DNA的核酸酶组成。该技术可以靶向特定位点的染色体DNA双链断裂(double-strandedbreaks,DSB)，以供体DNA为模板，促发同源定向修复(homologydirectedrepair,HDR)，或者以极易出错的NHEJ方式进行修复。其中HDR可对靶基因进行定点插入、缺失、修正等操作，而NHEJ由于极易出错，很容易导致靶基因发生插入、缺失和移码突变，从而实现对靶基因的破坏(genedisruption)。目前，主要的核酸酶修饰技术包括锌指核酸酶(Zincfingernucleases,ZFNs)，类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TAL-ENs)和规律成簇间隔短回文重复/Cas核酸酶(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedsystems,CRISPR/Cas)核酸酶。CRISPR/Ca-s核酸酶技术起步较晚，该技术操作起来最简单，但是，其潜在的完全性问题尚未得到证实。TALENs的主要优势在于不受靶序列特征的限制，但是特异识别靶序列的TALENs片段太长，不利于后续载体的装载和表达，并且在靶细胞内引入大量的重复序列也是未知的安全隐患。相比而言，虽然ZFNs构建过程较复杂，但其是人类基因编辑最确立的技术，技术成熟，免疫原性低，特异性较高，较适用于体内疗法，且已在基因治疗领域显示出良好的前景，是本研究较为理想的工具。
技术实现思路
针对以上问题，本专利技术一方面提供一种DNA分子，其序列如SEQIDNo:2所示。本专利技术的另一方面在于提供如SEQIDNo:2所示的DNA分子作为靶点在抑制人bcr-abl融合基因表达或导致人bcr-abl基因功能丧失中的应用；所述抑制人bcr-abl基因表达或导致人bcr-abl基因功能丧失是由锌指核酸酶介导的bcr-abl融合基因同源重组技术带来的。在上述技术方案中，所述人bcr-abl基因的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。所述的锌指核酸酶的锌指蛋白的核苷酸编码序列如SEQIDNo:3和4所示。所述的同源重组为同源定向修复，使用到的供体DNA的左臂扩增引物如SEQIDNo:7和8所示，右臂扩增引物如SEQIDNo:9和10所示。本专利技术的有益效果是：本专利技术定位了bcr-abl基因中一段特异的靶序列位点DNA片段，并针对此特异位点构建ZFN质粒，将此质粒核转染K562细胞可以使bcr-abl基因发生定点断裂,并以供体DNA为模板进行同源修复，使其插入8个碱基最终导致bcr-abl基因的破坏。本专利技术的显著优势表现在针对bcr-abl序列中特异的靶序列位点构建的ZFN质粒可高效靶向bcr-abl基因发生DNA双链断裂，以HDR方式进行修复使bcr-abl发生移码等突变而被破坏，从而丧失促增殖、抑凋亡等恶性转化潜能，证实ZFNs靶向破坏bcr-abl基因杀伤和抑制CML细胞的可行性。附图说明图1是鉴定转染ZFN质粒的K562细胞基因组DNA测序结果峰图。图2是K562细胞相关蛋白WesternBlot检测结果图，Blank：空白对照组；GFP:空载组。图3是K562细胞、GFP和ZFN-L/R+Donor质粒核转染K562细胞克隆形成镜下图，K562细胞：未处理细胞，GFP：空载质粒，ZFN-L/R+Donor：ZFNs和Donor同时作用于K562细胞。图4是GFP和ZFN-L/R+Donor质粒核转染K562细胞后细胞克隆形成数柱状图。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1、针对人bcr-abl基因特异靶位点序列的ZFN质粒和Donor质粒的设计与构建一、针对人bcr-abl基因特异靶位点序列的锌指核酸酶的设计合成根据NCBI的查询和拼接确定了人bcr-abl基因的基因序列(如SEQIDNo:1所示)，通过生物信息学的方法，完成ZFNs设计，确定了该人bcr-abl基因的锌指核酸酶作用的特异靶位点序列为：GGCGTCGACGGCgactacGAGGACGCCGAG(如SEQIDNo:2所示)；中间部分序列(gactac)为FokI内切核酸酶切割位点，也即ZFN特异敲除的靶位点序列，且本专利技术中所用的FokI内切核酸酶为专性异二聚化FokI质粒，购自Addgene公司，可避免同源二聚化导致的非特异切割。本专利技术中设计的针对人bcr-abl基因的锌指核酸酶(ZFNs)由锌指蛋白(ZFP)和FokI酶构成(1)锌指蛋白(ZFP)的左臂(ZFP-L)、右臂(ZFP-R)序列ZFP-L的DNA序列为(如SEQIDNo:3所示)：5’-GTCGACCTGGAGCCCGGCGAGAAGCCCTACAAGTGCCCCGAGTGCGGCAAGAGCTTCAGCGACTGCCGCGACCTGGCCCGCCACCAGCGCACCCACACCGGCGAGAAGCCCTACAAGTGCCCCGAGTGCGGCAAGAGCTTCAGCGACCCCGGCAACCTGGTGCGCCACCAGCGCACCCACACCGGCGAGAAGCCCTACAAGTGCCCCGAGTGCGGCAAGAGCTTCAGCGACCCCGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA分子，其特征在于：其序列如SEQ ID No:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种DNA分子，其特征在于：其序列如SEQIDNo:2所示。2.权利要求1所述的DNA分子作为靶点在抑制人bcr-abl融合基因表达或导致人bcr-abl基因功能丧失中的应用；所述抑制人bcr-abl基因表达或导致人bcr-abl基因功能丧失是由锌指核酸酶介导的bcr-abl融合基因同源重组技术带来的。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述人b...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯文莉，高淼，黄宁姝，黄峥兰，袁颖，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50