一种病毒/细菌的裂解液及荧光定量PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种病毒/细菌的裂解液及荧光定量PCR检测方法，属于生物检测领域。所述裂解液由NaCl、triton X‑100、十二烷基硫酸锂和EDTA‑2Na与纯化水混匀而成。采用本发明专利技术的裂解液，在PCR反应的过程中可以省略提纯DNA的步骤，样本的核酸提取和扩增检测在一个反应管中进行，无需加热，离心，震荡等分离或纯化操作，操作过程简单、方便、成本低廉，对操作人员要求极低，大幅度压缩了检测时间，特别适用于重大疾病的床边诊断和爆发重大疫情时的现场检验检疫工作。

A virus / bacterial lysate and a fluorescent quantitative PCR assay

The invention discloses a virus / bacteria lysis solution and a fluorescent quantitative PCR detection method, belonging to the field of biological detection. The lysates from NaCl, Triton X 100, twelve alkyl lithium sulfate and EDTA 2Na with purified water and mixing. The lysate of the invention, you can omit the DNA purification steps in the process of the PCR reaction, the sample nucleic acid extraction and amplification in a reaction tube, without heating, centrifugal, shock isolation or purification operation, simple operation, convenient, low cost, low requirements for operators. To substantially reduce the detection time, especially suitable for bedside diagnosis of major diseases and major epidemic outbreak of the inspection and quarantine work.

【技术实现步骤摘要】
一种病毒/细菌的裂解液及荧光定量PCR检测方法
本专利技术涉及病毒和细菌的核酸提取和检测
，具体涉及一种用于提取病毒、细菌核酸的裂解液及采用该裂解液进行荧光定量PCR的检测方法。
技术介绍
在现有技术中，血清、血浆中病毒提取方法主要有以下几种：一、煮沸法：向血清或血浆等病毒、细菌样本中加入裂解液，水浴或者干浴煮沸，高速离心取上清作为PCR模板，其优点是操作简单，缺点是提取的核酸杂质含量高，容易抑制后期PCR扩增，另外由于煮沸产生局部高压，容易造成气溶胶污染，导致检测结果阴阳不分。二、离心柱提取法：血清或血浆等病毒、细菌样本通过加入高盐低pH的裂解液，然后使用核酸吸附膜吸附，再使用洗涤液洗涤2-3次，最后使用低盐高pH值的洗脱液将核酸洗脱下来作为PCR模板。该方法提取的核酸纯度高，但是缺点是需要多次高速离心，手工操作繁杂，效率低，而且无法实现自动化。三、磁珠法：磁珠法可以视为离心柱法的改进，将吸附膜同功能物包裹在磁性纳米微粒上，血清或血浆等病毒、细菌样本通过加入高盐低pH值的裂解液，然后使用包裹了核酸吸附膜的纳米磁性微粒吸附，再使用洗涤液洗涤2-3次，最后使用低盐高pH值的洗脱液将核酸洗脱下来作为PCR模板。该方法提取的核酸纯度高，而且可以实现自动化提取，但是该技术需要操作人员具有较高的实验技能，不易推广，如果配备自动化设备，则会增加检测成本。上述几种提取方法中，采用了化学方法实现细胞破裂、核酸释放，再基于核酸比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性的特性将核酸进行分离、纯化，纯化步骤操作时间长、成本高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种操作简单、成本低廉的病毒/细菌的裂解液及荧光定量PCR检测方法，其能满足绝大多数临床常见病毒、细菌无需核酸纯化直接进行荧光定量PCR检测的要求，用以解决现有核酸提取过程中纯化时间长、操作繁琐、成本高的问题。为实现上述目的，本专利技术方法采用一种快速裂解病毒、细菌外壳蛋白释放出其遗传物质的裂解液，直接将其加入相应的PCR反应液中，即可实现针对待测病原微生物的定量或者定性检测。具体地，该病毒/细菌的裂解液，由NaCl、tritonX-100、十二烷基硫酸锂和EDTA-2Na与纯化水混匀而成，各组分的终浓度：NaCl为0.8～1.2M，tritonX-100为10v.％～15v.％，十二烷基硫酸锂为0.01％～0.05％w/v(即质量体积比)，EDTA-2Na为5～10mM。优选的，各组分的终浓度配比：NaCl为1M，tritonX-100为10v.％，十二烷基硫酸锂为0.02％，EDTA-2Na为5mM。优选的，各组分的终浓度配比：NaCl为1M，tritonX-100为12v.％，十二烷基硫酸锂为0.04％，EDTA-2Na为8mM。上述技术方案中，采用高浓度氯化钠有利于蛋白盐析变性从而与核酸分离；tritonX-100和十二烷基硫酸锂分别属于非离子型和离子型表面活性剂，利于病毒外壳蛋白裂解以及核酸与蛋白的分离，其中非离子型表面活性剂对后期PCR不会产生明显抑制，因此使用体积浓度优选10～15v.％，更优选10v.％，离子型活性剂在高剂量时会抑制掉PCR，因此优选使用0.01～0.05％w/v(质量体积比)，更优选0.04％w/v。EDTA-2Na可以与样品中二价金属离子形成螯合物，从而使得DNA酶没有催化剂，从而间接保护DNA不受降解。上述各组分之间协同作用，将病毒或细菌裂解后可以直接进行PCR扩增，绕开核酸提纯过程。本专利技术还提供了一种病毒/细菌的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：A、按照上述病毒/细菌的裂解液的配比，配制裂解液；B、提取病毒/细菌核酸：向PCR反应管中加入步骤A中所得裂解液和待检测血清或血浆样本，混匀、静置5～15min，得病毒/细菌的DNA样本；C、PCR扩增：向步骤B中所得DNA样本的PCR反应管中加入PCR反应液，置于荧光定量PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增和荧光检测。步骤A中配制裂解液的方法如下：向容器中加入46.8～70.2克(即0.8～1.2mol)氯化钠，100～150mLtritonX-100，1～5克的十二烷基硫酸锂，0.5MpH值为8.0的EDTA-2Na10～20mL，然后加纯化水600mL，混匀后，定容到1000mL。步骤B中所述PCR反应液包括：PCR缓冲溶液(PCRBuffer)、MgCl2、dNTPs、检测病毒/细菌的引物对和对应探针以及TaqDNA聚合酶或酶混合液。本专利技术方法具有如下优点：采用本专利技术的裂解液，在PCR反应的过程中可以省略提纯DNA的步骤，样本的核酸提取和扩增检测在一个反应管中进行，无需加热，离心，震荡等分离或纯化操作，操作过程简单、方便、成本低廉，对操作人员要求极低，大幅度压缩了检测时间，特别适用于重大疾病的床边诊断和爆发重大疫情时的现场检验检疫工作。附图说明图1是实施例2中4个梯度大肠杆菌的扩增曲线，其中横坐标表示循环数，纵坐标表示荧光强度。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1以猪圆环病毒2型(PCV-2)的荧光定量PCR检测为例，说明本专利技术裂解液的应用。A、配制裂解液：向容器中加入58.5克氯化钠，100mLtritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，2克的十二烷基硫酸锂，浓度为0.5M、pH值为8.0的EDTA-2Na溶液10mL，然后加纯化水600mL，混匀后，转移至容量瓶中，定容到1000mL。B、提取病毒/细菌核酸：向PCR反应管中加入步骤A中配制的裂解液5μL和待检测血清或血浆样本5μL，使用移液器反复吹打3次混匀，静置10min，得细菌的DNA样本；C、PCR扩增：向步骤B中所得DNA样本的PCR反应管中加入配制好的PCR反应液40μL，将PCR反应管置于荧光定量PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增和荧光检测，PCR扩增反应程序参见表1。本实施例采用型号为宏石SLAN-48P的荧光定量PCR仪进行检测。同时以纯化水作为阴性对照，以含有猪圆环病毒2型细菌的培养液作为阳性对照，分别按照上述条件进行PCR扩增和荧光检测。表1PCR反应程序和条件其中，PCR反应液的组分和浓度参见表2。表2PCR反应液的组分和浓度组分单人份用量(μL)5×PCRBuffer10MgCl2(1M)0.5dNTPs(25mM)0.5PCV-2-F(50pmol/μL)0.4PCV-2-R(50pmol/μL)0.4PCV-2-P(50pmol/μL)0.2TaqDNA聚合酶(5U/μL)1纯化水补足到40上述PCRBuffer的组分及浓度为：250mMtrisHCl、pH值为8.0,375mMKCl，25％(体积比)甘油，25％硫酸铵(体积比)。用于扩增猪圆环病毒2型的上游引物PCV-2-F、下游引物PCV-2-R和检测扩增猪圆环病毒2型的探针PCV-2-P采用现有技术中已经成熟的核苷酸序列即可，本实施例采用的核苷酸序列参见表3。表3用于检测猪圆环病毒2型的引物和探针序列按照上述的方法对54例猪圆环病毒2型血清样品进行检测。同时作为对照，对每例样品按照离心柱提取法进行核酸提纯，具体方法如下：在血清样本中加入高盐低pH值的裂解液，然后使用核酸吸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种病毒/细菌的裂解液，其特征在于，所述裂解液由NaCl、tritonX‑100、十二烷基硫酸锂和EDTA‑2Na与纯化水混匀而成，各组分的终浓度：NaCl为0.8～1.2M，triton X‑100为10v.％～15v.％，十二烷基硫酸锂为0.01％～0.05％w/v，EDTA‑2Na为5～10mM。

【技术特征摘要】
1.一种病毒/细菌的裂解液，其特征在于，所述裂解液由NaCl、tritonX-100、十二烷基硫酸锂和EDTA-2Na与纯化水混匀而成，各组分的终浓度：NaCl为0.8～1.2M，tritonX-100为10v.％～15v.％，十二烷基硫酸锂为0.01％～0.05％w/v，EDTA-2Na为5～10mM。2.根据权利要求1所述的病毒/细菌的裂解液，其特征在于，各组分的终浓度配比：NaCl为1M，tritonX-100为10v.％，十二烷基硫酸锂为0.02％，EDTA-2Na为5mM。3.根据权利要求1所述的病毒/细菌的裂解液，其特征在于，各组分的终浓度配比为：NaCl为1M，tritonX-100为12v.％，十二烷基硫酸锂为0.04％，EDTA-2Na为8mM。4.一种病毒/细菌的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A、按照权利要求1所述病毒/细菌的裂解液的配比，配制裂解液；B、提取病毒/细菌核酸：向PCR反应管中加入步骤A中所得裂解液和待检测血清或血浆样...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚小鹏，韩典霖，杨亮，
申请(专利权)人：济凡生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11