一种具有抗氧化活性的Κ‑卡拉胶寡糖制备方法技术

本发明专利技术涉及K‑卡拉胶寡糖领域，具体地说是一种具有抗氧化活性的K‑卡拉胶寡糖制备方法。其包括K‑卡拉胶酶的制备和K‑卡拉胶寡糖的制备，还包括K‑卡拉胶寡糖的清除羟自由基能力的测定和K‑卡拉胶寡糖的清除超氧阴离子能力的测定方法。本发明专利技术制备方法比现有的制备方法更简单、快捷。本发明专利技术采用酶法降解，使得制备过程简单快捷、产物的率高、质量稳定，并且该产品具有抗氧化活性，具有开发具有抗氧化功能的保健食品的前景。

A kind of antioxidant kappa carrageenan oligosaccharides preparation method

The present invention relates to the field of K oligocarrageenan, in particular to an antioxidant activity K carrageenan oligosaccharides preparation method. The K Carrageenase preparation and K carrageenan oligosaccharides preparation, determination methods include K carrageenan oligosaccharides hydroxyl radical scavenging ability and determination of K carrageenan oligosaccharides superoxide anion capacity. The preparation method of the invention is simpler and faster than the existing preparation method. The invention is degraded by enzyme method, so that the preparation process is simple and quick, the product rate is high, the quality is stable, and the product has antioxidant activity, and has the prospect of developing health-care food with antioxidation function.

【技术实现步骤摘要】
一种具有抗氧化活性的K-卡拉胶寡糖制备方法
本专利技术涉及K-卡拉胶寡糖领域，具体地说是一种具有抗氧化活性的K-卡拉胶寡糖制备方法。
技术介绍
卡拉胶作为一种结构独特的天然海洋硫酸多糖，被称为类肝素多糖，其生物活性已经成为当前多糖研究领域中的一个热点。近年来，卡拉胶在生理学和病理学研究中所显出来的生物活性已相继被人们发现。实验研究显示，卡拉胶具有抗血管新生、抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗菌、抗病毒、降血糖等生物学活性。但由于卡拉胶多糖分子量较大，溶解性和吸收性较差，结构复杂等原因，限制了其应用。而卡拉胶寡糖分子量较小，溶解性增强，结构简化，易于吸收，稳定性和安全性都有所增加，多糖链经过不同形式的断裂后活性基团充分暴露，其活性较卡拉胶有显著提高，同时寡糖还具有低毒性的特征，因此拓宽了卡拉胶的应用范围，目前卡拉胶寡糖活性的研究已日益受到关注。卡拉胶寡糖是从红藻细胞壁中提取得到的一种水溶性硫酸寡糖，主要存在于红藻纲的角叉菜属(Chondrus)、杉藻属(Gigartina)、麒麟菜属(Eucheuma)和沙菜属中。卡拉胶寡糖的基本结构是由β(1→3)-D-吡喃半乳糖(G)和α(1→4)-D-吡喃半乳糖(D)为基本骨架交替连接形成的硫酸线性寡糖。根据是否含有3，6-内醚半乳糖以及半乳糖上的硫酸基团的含量和分子中半乳糖所连接的位置不同，卡拉胶寡糖可分为八种类型：K-卡拉胶寡糖、γ-卡拉胶寡糖、ι-卡拉胶寡糖、ω-卡拉胶寡糖、λ-卡拉胶寡糖、υ-卡拉胶寡糖、ψ-卡拉胶寡糖、ξ-卡拉胶寡糖。常用的卡拉胶寡糖主要有K-、ι-、λ-型。目前卡拉胶寡糖的制备主要有化学降解、物理降解和酶降解三种方法。化学和物理降解方法存在反应条件不易控制、降解产物不均一等缺点，在工业生产中受到限制，而酶降解法可以最大程度地保护反应底物的活性基团不会在降解过程中受到破坏，降解产物均一，反应条件温和，产物活性较高。在酶解制备卡拉胶寡糖方法有报道，但是未见具有抗氧化活性的酶解K-卡拉胶寡糖的报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供一种具有抗氧化活性的K-卡拉胶寡糖制备方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种具有抗氧化活性的K-卡拉胶寡糖制备方法，包括以下步骤：(a)K-卡拉胶酶的制备将CellulophagalyticastrainN5-2菌种接种于活化培养基中，于20-30℃、150-250rpm/min摇床中培养15-20h，进行培养活化，得到种子液；按2-4％的接种量将种子液接种到发酵培养基中，于20-30℃、150-250rpm/min摇床中培养15-20h，得到发酵液；将发酵液在4℃条件下，于4000-5000r/min冷冻离心20min，离心后取上清液，得到粗酶液；(b)K-卡拉胶寡糖的制备K-卡拉胶的溶解：用0.1mol/L的Na2HPO4·12H2O将K-卡拉胶配置为浓度为1％的溶液，在40℃加热搅拌使之完全溶解，K-卡拉胶的酶解：将粗酶液与溶解的K-卡拉胶溶液按照1:7～10的体积比混合，于40℃水浴加热搅拌5-10min，酶解液灭活：将酶解后的液体于100℃灭活15min，酶解液离心：将酶解灭活的产物于8000r/min，高速离心10min；酶解液冻干：酶解液离心物真空冷冻干燥，得到K-卡拉胶寡糖粉末。进一步的，本专利技术还包括上述具有抗氧化活性的K-卡拉胶寡糖的清除羟自由基能力的测定，其包括以下步骤：取1.0mL浓度为1.865mmol/L邻二氮菲的无水乙醇溶液于带塞试管中，分别加入浓度为0.2M的pH7.4磷酸盐缓冲液2mL和1mL不同浓度系列的K-卡拉胶寡糖混合，浓度系列为1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml，充分混合后加入1.0mL浓度为1.865mmol/L的FeSO4·7H2O溶液，再次混匀后加入1.0mL0.03％(v/v)的H2O2，于37℃恒温水浴，保持60min；最后，在536nm下分别测量各组混合溶液的吸光度值AS，以蒸馏水代替样品作为空白组测吸光度值Ab，以蒸馏水替代H2O2作为损伤组，测吸光度An，以抗坏血酸代替样品作为阳性对照，抗氧化剂的羟自由基清除率按以下公式计算：羟自由基清除率(％)＝[(As-An)/(Ab-An)]×100。进一步的，本专利技术还包括上述具有抗氧化活性的K-卡拉胶寡糖的清除超氧阴离子能力的测定，包含以下步骤：在96孔板孔中依次加入黄嘌呤与NBT的混合液、100μL的0.049units/ml黄嘌呤氧化酶、50μL不同浓度系列的K-卡拉胶寡糖溶液，混匀；混匀后于37℃孵育30min，酶标仪测OD560值，不加样品溶液作为空白对照，维生素C为阳性对照，每个浓度的样品平行测定三次，分别计算清除率；样品清除率＝(OD空白-OD样品)/OD空白×100％。进一步的，上述中的黄嘌呤与NBT的混合液是将50μL黄嘌呤0.4mmol/l和50μLNBT0.24mmol/l溶于0.01mol/lpH＝8.0的PBS中，定容至150ml；不同浓度系列的K-卡拉胶寡糖分别为1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml。本专利技术制备方法比现有的制备方法更简单、快捷。本专利技术采用酶法降解，使得制备过程简单快捷、产物的率高、质量稳定，并且该产品具有抗氧化活性，具有开发具有抗氧化功能的保健食品的前景。附图说明图1为K-卡拉胶寡糖HPLC检测图；图2为K-卡拉胶四糖ESI-MS检测图；具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例对本专利技术进行进一步详细说明。一种具有抗氧化活性的K-卡拉胶寡糖的制备方法具体包括：一、K-卡拉胶酶的制备1、将筛选的CellulophagalyticastrainN5-2菌种先接种于活化培养基中，于20-30℃、150-250rpm/min摇床培养15-20h，进行培养活化，得到种子液。2、按2-4％的接种量将种子液接种到发酵培养基中，20-30℃、150-250rpm/min摇床培养15-20h。3、将发酵液在4℃条件下，4000-5000r/min冷冻离心20min，离心后取上清液，即为粗酶液。二、K-卡拉胶寡糖的制备1、K-卡拉胶的溶解：用0.1mol/L的Na2HPO4·12H2O将K-卡拉胶配置为浓度为1％的溶液，40℃加热搅拌使之完全溶解。2、K-卡拉胶的酶解，将制备好的粗酶液与步骤1溶解的K-卡拉胶溶液按照1:7-10的体积比混合，40℃水浴加热搅拌5-10min即可。3、酶解液灭活，将酶解后的液体100℃灭活15min；4、酶解液离心，酶解的产物8000r/min，高速离心10min；5、酶解液冻干，酶解液真空冷冻干燥后的K-卡拉胶寡糖粉末。三、K-卡拉胶寡糖的检测分析1、高效液相色谱(HPLC)分析检测仪器：美国戴安DionexUltiMate3000液相色谱仪，色谱条件：色谱柱KromasilC18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：磷酸盐缓冲液/乙腈(83:17，V/V)；检测器：二极管阵列紫外检测器(DAD)。表1K-卡拉胶寡糖HPLC检测结果由上表1及图1所示，K-卡拉胶寡糖主要含有K-卡拉胶二糖、四糖、六糖、八糖。根据高效液相色谱对降解后得到的K-卡拉胶寡糖的分析，其主本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有抗氧化活性的K‑卡拉胶寡糖制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(a)K‑卡拉胶酶的制备将Cellulophagalytica strain N5‑2菌种接种于活化培养基中，于20‑30℃、150‑250rpm/min摇床中培养15‑20h，进行培养活化，得到种子液；按2‑4％的接种量将种子液接种到发酵培养基中，于20‑30℃、150‑250rpm/min摇床中培养15‑20h，得到发酵液；将发酵液在4℃条件下，于4000‑5000r/min冷冻离心20min，离心后取上清液，得到粗酶液；(b)K‑卡拉胶寡糖的制备K‑卡拉胶的溶解：用0.1mol/L的Na2HPO4·12H2O将K‑卡拉胶配置为浓度为1％的溶液，在40℃加热搅拌使之完全溶解；K‑卡拉胶的酶解：将粗酶液与溶解的K‑卡拉胶溶液按照1:7～10的体积比混合，于40℃水浴加热搅拌5‑10min；酶解液灭活：将酶解后的液体于100℃灭活15min；酶解液离心：将酶解灭活的产物于8000r/min，高速离心10min；酶解液冻干：酶解液离心物真空冷冻干燥，得到K‑卡拉胶寡糖粉末。

【技术特征摘要】
1.一种具有抗氧化活性的K-卡拉胶寡糖制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(a)K-卡拉胶酶的制备将CellulophagalyticastrainN5-2菌种接种于活化培养基中，于20-30℃、150-250rpm/min摇床中培养15-20h，进行培养活化，得到种子液；按2-4％的接种量将种子液接种到发酵培养基中，于20-30℃、150-250rpm/min摇床中培养15-20h，得到发酵液；将发酵液在4℃条件下，于4000-5000r/min冷冻离心20min，离心后取上清液，得到粗酶液；(b)K-卡拉胶寡糖的制备K-卡拉胶的溶解：用0.1mol/L的Na2HPO4·12H2O将K-卡拉胶配置为浓度为1％的溶液，在40℃加热搅拌使之完全溶解；K-卡拉胶的酶解：将粗酶液与溶解的K-卡拉胶溶液按照1:7～10的体积比混合，于40℃水浴加热搅拌5-10min；酶解液灭活：将酶解后的液体于100℃灭活15min；酶解液离心：将酶解灭活的产物于8000r/min，高速离心10min；酶解液冻干：酶解液离心物真空冷冻干燥，得到K-卡拉胶寡糖粉末。2.包含如权利要求1所述的具有抗氧化活性的K-卡拉胶寡糖的清除羟自由基能力的测定。3.根据权利要求2所述的具有抗氧化活性的K-卡拉胶寡糖的清除羟自由基能力的测定，其特征在于：包括以下步骤：取1.0mL浓度为1.865mmol/L邻二氮菲的无水乙醇溶液于带塞试管中，分别加入浓度为0.2M的pH7.4磷酸盐缓冲液2mL和1mL不同浓度系列的K-卡拉胶寡糖混合，浓度系列为1mg/ml、2mg/ml、4m...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽丽，张斌，管昶，徐小龙，高芹芹，岳帆，
申请(专利权)人：青岛博智汇力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37