一种能够验证酶解效果的基于酶解多肽原理的蛋白质检测技术制造技术

本发明专利技术公开了一种能够验证酶解效果的基于酶解多肽原理的蛋白质检测技术，对酶解物中验证肽和特异肽进行检测，并根据检测结果验证待测蛋白质样品的酶解效果；若通过酶解效果验证，表示特异肽已完全从待测蛋白质样品酶解出来，则用所获得的特异肽浓度乘以待测蛋白质样品的分子量获得蛋白质的质量浓度；若未通过酶解效果验证，表示特异肽未完全从待测蛋白质样品酶解出来，则须将酶解物再次进行酶解优化处理；所述验证肽中至少含有一个或一个以上在待测蛋白质中最后被所述酶所酶解的位点；或所述验证肽为所述特异肽向N端或者C端延长至一个或一个以上酶解位点的多肽。本发明专利技术可以对特异肽是否已完全从待测蛋白质样品酶解得到，进行有效的验证，并且通过检测特异肽的方法，准确测定蛋白质的浓度。

A protein detection technique based on the principle of enzymatic hydrolysis of peptides

The invention discloses an enzyme able to verify the detection of protein peptides based on the principle of solution effect, of hydrolysate peptide and peptide specific validation test and verify the effect of enzymatic hydrolysis of the protein to be tested samples according to the detection result; if the enzymolysis effect validation, said specific peptide has been completely from the measured protein samples of enzyme, with the specific peptide concentration to be multiplied by the amount of the sample for measurement of protein molecular mass concentration of protein; enzymolysis effect if not through the verification, said the specific peptide is not completely from the measured enzyme protein samples, shall be hydrolyzed by enzymatic treatment again by optimization; the validation of peptide containing at least one or more in the protein was finally the enzyme enzyme sites to be tested; or the validation of peptide for the specific peptide to the N terminal or C terminal is extended to one or a Polypeptide at more than one enzymolysis site. The invention can effectively verify whether the specific peptide has been completely obtained from the protein sample to be tested, and accurately determine the concentration of the protein by detecting the specific peptide.

【技术实现步骤摘要】
一种能够验证酶解效果的基于酶解多肽原理的蛋白质检测技术
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种能够验证酶解效果的基于酶解多肽原理的蛋白质检测技术。
技术介绍
定量蛋白质组学的目的是对复杂的混合体系中所有的蛋白质进行鉴定，并对蛋白质的量及量的变化进行准确的测定，是当前生命科学研究的重要内容。近年来，由于质谱技术和生物信息学的进步，定量蛋白质组学在分析蛋白质组或亚蛋白质组方面已取得了令人瞩目的成就。在种种成熟的蛋白质定量分析技术中，最普遍的技术是基于三重四极杆质谱(triplequadrupole)，在选择反应监控模式(selectedreactionmonitoring，SRM)下对蛋白质中特异肽进行检测。在完全酶解的情况下，特异肽的摩尔浓度与对应蛋白质的摩尔浓度相同，故可以通过其与蛋白质分子量计算获得蛋白质的质量浓度。如公开号为CN103616454A的专利文献公开了一种定量检测人β-酪蛋白含量的方法以及试剂盒，该方法中利用人β-酪蛋白酶解后所获得的特异多肽序列，设计出同位素标记的特异肽和同位素标记内标物的序列，并基于内标法对人β-酪蛋白进行定量检测。在过去的10年间，虽然产生了许多方法提高特异肽的检测准确度，主要包括各种同位素内标标记策略，但是一直缺乏一种简单有效的方法，用于验证蛋白质是否完全酶解、目标特异肽是否完全从蛋白质中释放出来。如果不对蛋白质酶解效果进行有效的验证，对于后续所有的提高特异肽检测准确度的研究也就无从说起。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种能够验证酶解效果的基于酶解多肽原理的蛋白质检测技术，可以对特异肽是否已完全从待测蛋白质样品酶解得到，进行有效的验证，以获得准确的特异肽的浓度。本专利技术的技术方案为：一种能够验证酶解效果的基于酶解多肽原理的蛋白质检测技术，包括：(1)采用酶对待测蛋白质样品进行酶解，得到酶解物；(2)对所述酶解物中验证肽和特异肽进行检测，并根据检测结果验证待测蛋白质样品的酶解效果；(3)若通过酶解效果验证，表示特异肽已完全从待测蛋白质样品酶解得到，则用所获得的特异肽浓度乘以待测蛋白质样品的分子量获得蛋白质的质量浓度；(4)若未通过酶解效果验证，表示特异肽未完全从待测蛋白质样品酶解得到，则将酶解物再次进行酶解优化处理；所述验证肽中至少含有一个或一个以上在待测蛋白质中最后被所述酶所酶解的位点；或，所述验证肽为所述特异肽向N端或者C端延长至一个或一个以上酶解位点的多肽。本专利技术通过检测酶解物中的验证肽来判断蛋白质是否被完全酶解、所有特异肽是否从蛋白质中完全释放出来。本专利技术中对于验证肽的选择来说，可以选择含有最难以被酶解(酶解时间最长)的酶解位点的多肽作为验证肽，若含有最难以酶解位点的多肽已经酶解完全，那么则特异肽已完全从待测蛋白质样品酶解得到。一般来说，为每个蛋白质只需选择一条多肽作为特异肽。在此情况下，所以无需追求蛋白质彻底水解，只要保证所选择的特异肽完全释放出来即可。因此本专利技术在此情况下，本专利技术还可以选择特异肽向N端或者C端延长至一个或一个以上酶解位点的多肽作为验证肽。本专利技术中验证肽的选择有多种，作为优选，所述验证肽为所述特异肽向特异肽的N端延长至下一个酶解位点的多肽。对于位于蛋白质C端的特异肽，可以选择向N端延伸至下一个酶解位点的多肽作为验证肽。作为优选，所述验证肽为所述特异肽向特异肽的C端延长至下一个酶解位点的多肽。对于位于蛋白质N端的特异肽，可以选择向C端延伸至下一个酶解位点的多肽作为验证肽。作为优选，步骤(2)中，所述验证肽和特异肽采用液相色谱-质谱联用技术同时检测。本专利技术中对验证肽进行检测时，可以采用与特异肽相同的检测方法，其中预处理方法和仪器通用参数与特异肽完全一致，仅增加验证肽专属的SRM参数。因此本专利技术可以在不增加实验操作和成本的前提下，仅通过参数的设置即实施成本专利技术，从而本专利技术具有很高的便利性和实用性。本专利技术中采用液相色谱-质谱联用技术对验证肽进行检测时，为了降低检测误差，本专利技术需要合理设置验证肽的检测参数，由于仪器品牌型号、状态、信号的表达方式的差异，相同浓度的验证肽在不同设备上所产生的信号也不同。所以验证肽的阈值无法是一个绝对值，而是是一个相对值，作为优选，所述验证肽的信号强度阈值设置为所述特异肽信号强度的1％。若验证肽的信号强度小于所述验证肽的信号强度阈值时，则特异肽已完全从待测蛋白质样品酶解得到，反之，特异肽未完全从待测蛋白质样品酶解得到。作为优选，所述验证肽的信噪比低于3。若验证肽的信号强度小于所述验证肽的信噪比时，则特异肽已完全从待测蛋白质样品酶解得到，反之，特异肽未完全从待测蛋白质样品酶解得到。与现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在：本专利技术中若酶解产物中含有所述验证肽时，则特异肽未完全从待测蛋白质样品中酶解得到，待测蛋白质样品还需再次进行酶解，可以再一次进行酶解优化处理，并重复对验证肽和特异肽的检测过程，直至酶解产物中不含有所述验证肽；反之，若酶解产物中未含有所述验证肽时，则特异肽完全从待测蛋白质样品中酶解得到，因此本专利技术可以通过对验证肽的检验来验证蛋白质的酶解效果，从而可以对于待测蛋白质是否酶解完全释放得到所对应的特异肽进行鉴定，以获得准确的特异肽的浓度，进而准确的换算出待测蛋白质的含量。具体实施方式实施例1(验证肽的筛选方法)取1mgβ乳球蛋白，溶于1mL水中。取100μL上述溶液，于2mL塑料离心管中，依次加入10μL二硫苏糖醇溶液(100mmol/L)和865μL碳酸氢铵溶液(500mM)，混合均匀后在70℃水浴锅中孵育30min；加入10μL碘代乙酰胺(300mmol/L)溶液，混合均匀后在室温环境中避光静置30min；加入胰蛋白酶溶液10μL，于37℃水浴锅中反应10、20、30、40、50、60、70、80、90、120、180、240min；样品在完成反应后迅速加入5μL甲酸溶液，通过0.22μm滤膜过滤。上述样品首先在高分辨质谱进行多肽的筛选，其高效液相色谱参数如下：高效液相色谱仪：ThermoScientificEasy-nLC1000；色谱柱：Easy-spraycolumn(C18，2μm，75μmx50cm)；上样量：2μL；流动相：A相：含0.1％甲酸、2％乙腈的水溶液；B相：含0.1％甲酸的乙腈溶液；液相色谱梯度：B相在2分钟内从3上升至8％，在80分钟内从8％上升至20％，在10分钟内从20％上升至30％，在5分钟内从30％上升至70％，在3分钟内从70％上升至90％，在90％维持20分钟。流速：250nL/min；质谱参数如下：质谱仪：ThermoScientificQExactive；喷雾电压：2kV；毛细管温度：250℃；S-lens：55％；碰撞能量：27％HCD；分辨率设置：一级70000@m/z200，二级17500@m/z200；母离子扫描范围：m/z300-1800；子离子扫描范围：从m/z100开始；Data-dependentMS/MS：Top20；多肽筛查软件设置如下：蛋白质一级序列数据库：P02754(采集自UniprotKB)；蛋白酶：胰蛋白酶；最大漏切位点：1；固定修饰：C烷基化；可变修饰：M氧化；通过上述方法所测得包含1个漏切位点的多肽可视作候选验证本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够验证酶解效果的基于酶解多肽原理的蛋白质检测技术，其特征在于，包括：(1)采用酶对待测蛋白质样品进行酶解，得到酶解物；(2)对所述酶解物中验证肽和特异肽进行检测，并根据检测结果验证待测蛋白质样品的酶解效果；(3)若通过酶解效果验证，表示特异肽已完全从待测蛋白质样品酶解得到，则用所获得的特异肽浓度乘以待测蛋白质样品的分子量获得蛋白质的质量浓度；(4)若未通过酶解效果验证，表示特异肽未完全从待测蛋白质样品酶解得到，则将酶解物再次进行酶解优化处理；所述验证肽中至少含有一个或一个以上在待测蛋白质中最后被所述酶所酶解的位点；或，所述验证肽为所述特异肽向N端或者C端延长至一个或一个以上酶解位点的多肽。

【技术特征摘要】
1.一种能够验证酶解效果的基于酶解多肽原理的蛋白质检测技术，其特征在于，包括：(1)采用酶对待测蛋白质样品进行酶解，得到酶解物；(2)对所述酶解物中验证肽和特异肽进行检测，并根据检测结果验证待测蛋白质样品的酶解效果；(3)若通过酶解效果验证，表示特异肽已完全从待测蛋白质样品酶解得到，则用所获得的特异肽浓度乘以待测蛋白质样品的分子量获得蛋白质的质量浓度；(4)若未通过酶解效果验证，表示特异肽未完全从待测蛋白质样品酶解得到，则将酶解物再次进行酶解优化处理；所述验证肽中至少含有一个或一个以上在待测蛋白质中最后被所述酶所酶解的位点；或，所述验证肽为所述特异肽向N端或者C端延长至一个或一个以上酶解位点的多肽。2.如权利要求1所述的能够验证酶解效果的基于酶解多肽原...

【专利技术属性】
技术研发人员：李森康，
申请(专利权)人：李森康，
类型：发明
国别省市：浙江,33