通过PCR添加剂解决等位基因扩增不平衡的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过PCR添加剂解决等位基因扩增不平衡的方法。该方法是针对由于“部分待测等位基因在PCR扩增过程中解链形成复杂二级结构或/和DNA双链解链不充分”而导致的等位基因扩增不平衡的情况的，包括如下步骤：通过向原有PCR反应体系中加入PCR添加剂，来降低双螺旋DNA的稳定性，从而解决等位基因扩增不平衡的问题；所述原有PCR反应体系为所述对待测等位基因进行PCR扩增出现等位基因扩增不平衡情况时所采用的PCR反应体系。实验证明，该方法确实可以有效的解决由于“部分待测等位基因在PCR扩增过程中解链形成复杂二级结构或/和DNA双链解链不充分”而导致的等位基因扩增不平衡。

Method for resolving allelic gene amplification disequilibrium by PCR additive

The present invention discloses a method for resolving allelic gene amplification disequilibrium by PCR additive. This method is due to \part of the measured allele in the PCR amplification process solution chain formation complex two level structure and / or DNA double chain chain solution is not sufficient\ as a result of the allele amplification imbalance situation, which comprises the following steps: by adding PCR additive to the original PCR reaction system, stability to reduce the DNA double helix, so as to solve the allele amplification imbalance; the original reaction system of PCR was amplified by PCR allele amplification reaction system using the PCR imbalance situation for the detected allele. Experiments show that this method can effectively solve the \part of the measured allele in the PCR amplification process solution chain formation complex two level structure and / or DNA double chain chain solution is not sufficient\ as a result of the allele amplification imbalance.

【技术实现步骤摘要】
通过PCR添加剂解决等位基因扩增不平衡的方法
本专利技术属于基因扩增领域，涉及一种解决等位基因扩增不平衡的方法，具体涉及一种通过PCR添加剂解决等位基因扩增不平衡的方法。
技术介绍
PCR技术即基于聚合酶链式反应，是一种可以特异放大扩增特定基因片段的技术，可以使基因片段数万倍的增加。其原理的核心是寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合杂交，形成部分双链，在DNA聚合酶的作用下进行DNA合成。而寡核苷酸引物与单链DNA模板的结合是基于碱基配对原则：碱基配对遵循G(鸟嘌呤)：C(胞嘧啶)、A(腺嘌呤)：T(胸腺嘧啶)/U(尿嘧啶)的Watson-Crick碱基配对原则。人体内每个细胞内有23对染色体，通常基因为双等位基因。进行普通PCR扩增时，两个等位基因一般情况下没有扩增效率的差异。但在复杂基因时，影响PCR扩增效率的因素会导致两个等位基因的扩增效率存在明显扩增差异，即等位基因扩增不平衡，严重时可出现一个等位基因扩增产量极少(扩增失败)，杂合的等位基因被错误的检测为纯合等位基因。例如HLA基因就是典型的复杂基因，具有高GC含量、高度同源性，高度多态性等特点。目前，HLA基因总数已经超过1万个，这些基因的有效扩增是HLA高分辨分型的重要基础。但以上特点决定了HLA基因的扩增引物设计特别困难以及扩增难度很高，容易出现HLA基因非特异扩增、等位基因丢失或等位基因扩增不平衡等问题，即相应基因扩增效率低或失败(扩增不平衡)使杂合基因位点丢失一个等位基因，分型错误为纯合基因位点。PCR过程中，两个等位基因的DNA双链会发生解链。其中一个等位基因解链时，由于碱基配对，单链DNA因自身序列碱基特点可能会形成复杂二级结构；或者由于序列碱基特点使DNA双链解链不充分，这些对DNA聚合酶延伸产生影响，从而影响PCR的扩增效率；但另外一个等位基因扩增效率却正常。这就导致了两个等位基因扩增效率的差异，即等位基因扩增不平衡。针对以上出现的等位基因扩增不平衡现象，现有技术采用如下策略进行解决：针对扩增效率低的等位基因设计特异性引物，使用特异性扩增的方式解决。然而现有的解决方案存在着如下弊端：特异性扩增单个等位基因，在面临高度复杂的基因，例如HLA基因，有大量的等位基因。有些等位基因会因复杂二级结构或解链不充分等导致扩增不平衡。如果采用发现一个等位基因扩增不平衡，就设计一条特异性引物策略，很快就会面临需要设计大量引物，引物设计极其困难的情况。
技术实现思路
为了有效的解决等位基因扩增不平衡的问题，本专利技术提供了一种解决等位基因扩增不平衡的方法。本专利技术所提供的解决等位基因扩增不平衡的方法，是针对由于“部分待测等位基因在PCR扩增过程中解链形成复杂二级结构或/和DNA双链解链不充分，而其余待测等位基因扩增效率正常”而导致的等位基因扩增不平衡的情况的，具体可包括如下步骤：通过向原有PCR反应体系中加入PCR添加剂，来降低双螺旋DNA的稳定性，使二级结构易于打开，DNA聚合酶延伸时更加容易通过二级结构区，从而解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题；所述原有PCR反应体系为：对所述待测等位基因进行PCR扩增，出现所述待测等位基因扩增不平衡情况时所采用的PCR反应体系。其中，所述PCR添加剂是PCR反应中的一种增效剂，在PCR反应中传统上起到提高PCR反应的特异性、增加PCR扩增的产量及防止无效扩增等有益效果。在所述方法中，所述PCR添加剂可为任意PCR添加剂中的任一种或任几种，例如：甜菜碱、甲酰胺、DMSO等。其中，向所述原有PCR反应体系中加入的所述PCR添加剂的量以达到所述待测等位基因扩增平衡，即等位基因扩增效率接近或一致为度。所述方法中，在PCR扩增体系中，可以以浓度梯度形式，逐步增加所述PCR添加剂的量，一直增加至能使所述待测等位基因扩增平衡，即等位基因扩增效率接近或一致。在所述方法中，所述待测等位基因可为任意基因，特别是高度复杂的基因，例如HLA基因，具体如HLA-DQB1基因。在本专利技术中，所述待测等位基因具体为基因型分别为DQB1*03:03:02(IMGT/HLAAccNo:HLA00629)和DQB1*06:01:01(IMGT/HLAAccNo:HLA00643)的HLA-DQB1基因。在本专利技术的第一个实例中，是通过向所述原有PCR反应体系中加入0.4-0.6M的甜菜碱来解决所述待测等位基因(基因型分别为DQB1*03:03:02和DQB1*06:01:01的HLA-DQB1基因)扩增不平衡的问题的。在本专利技术的第二个实例中，是通过向所述原有PCR反应体系中加入1％-2.5％体积百分含量的甲酰胺来解决所述待测等位基因(基因型分别为DQB1*03:03:02和DQB1*06:01:01的HLA-DQB1基因)扩增不平衡的问题的。在本专利技术的第三个实例中，是通过向所述原有PCR反应体系中加入1％-5％体积百分含量的DMSO来解决所述待测等位基因(基因型分别为DQB1*03:03:02和DQB1*06:01:01的HLA-DQB1基因)扩增不平衡的问题的。对所述基因型分别为DQB1*03:03:02和DQB1*06:01:01的HLA-DQB1基因进行PCR扩增时，采用的引物对为由序列表中序列1和序列2所示的两条DNA单链组成的引物对。相应的，所述原有PCR反应体系具体参见实施例1。对所述基因型分别为DQB1*03:03:02和DQB1*06:01:01的HLA-DQB1基因进行PCR扩增时，扩增程序如下：96℃3min；96℃25s，60℃45s，72℃45s，35个循环；72℃5min；12℃保存。本专利技术针对由于“部分待测等位基因在PCR扩增过程中解链形成复杂二级结构或/和DNA双链解链不充分，而其余待测等位基因扩增效率正常”而导致的等位基因扩增不平衡的情况，提供了通过向原有PCR反应体系中加入一定浓度的PCR添加剂解决等位基因扩增不平衡的方法。实验证明，该方法确实可以有效的解决由于部分待测等位基因在PCR扩增过程中解链形成复杂二级结构或/和DNA双链解链不充分，而其余待测等位基因扩增效率正常而导致的等位基因扩增不平衡。附图说明图1为对DQB1*03:03:02/DQB1*06:01:01组合样品进行PCR扩增时反应体系中加入不同浓度甜菜碱组的测序结果。图2为对DQB1*03:03:02/DQB1*06:01:01组合样品进行PCR扩增时反应体系中加入不同浓度甲酰胺组的测序结果。图3为对DQB1*03:03:02/DQB1*06:01:01组合样品进行PCR扩增时反应体系中加入不同浓度DMSO组的测序结果。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例、通过PCR添加剂解决等位基因扩增不平衡PCR添加剂是PCR反应中的一种增效剂，常见种类有甲酰胺、甜菜碱、DMSO等。本专利技术研究发现，PCR添加剂可以降低双螺旋DNA的稳定性，使二级结构易于打开，有助于DNA聚合酶延伸通过二级结构区。对于PCR过程中，两个等位基因中的一个等位基因的单链形成复杂二级结构或DNA双链解链不充分，导致两个等位基因扩增效率不一致即扩增不平衡的问题，可以加入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种解决由于“部分待测等位基因在PCR扩增过程中解链形成复杂二级结构或/和DNA双链解链不充分”而导致的等位基因扩增不平衡的方法，包括如下步骤：通过向原有PCR反应体系中加入PCR添加剂，来降低双螺旋DNA的稳定性，从而解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题；所述原有PCR反应体系为：所述对待测等位基因进行PCR扩增，出现所述待测等位基因扩增不平衡情况时所采用的PCR反应体系。

【技术特征摘要】
1.一种解决由于“部分待测等位基因在PCR扩增过程中解链形成复杂二级结构或/和DNA双链解链不充分”而导致的等位基因扩增不平衡的方法，包括如下步骤：通过向原有PCR反应体系中加入PCR添加剂，来降低双螺旋DNA的稳定性，从而解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题；所述原有PCR反应体系为：所述对待测等位基因进行PCR扩增，出现所述待测等位基因扩增不平衡情况时所采用的PCR反应体系。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PCR添加剂为甜菜碱、甲酰胺、DMSO或其它PCR添加剂中的任一种或任几种。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：向所述原有PCR反应体系中加入的所述PCR添加剂的量以达到所述待测等位基因扩增平衡为度。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述待测等位基因为HLA基因或其他任意基因。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述待测等位基因为基因型分别为DQB1*03:03:02和DQB1*06:01:01的HLA-DQB1基因。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法中，是通过...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘湘，兰更欣，赵晓丹，王雷，陈璐，秦雪菲，李锦绣，
申请(专利权)人：北京博奥晶典生物技术有限公司，成都博奥晶芯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11