一种抗生素FusaricidinA的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种抗生素FusaricidinA的制备方法，包括以下步骤：(a)将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于麸皮培养基中进行发酵，得到发酵液；(b)将发酵液离心取上清，灭活蛋白酶，待冷却后，萃取取正丁醇相，去除有机相，得到粗品1；(c)将粗品1分离，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得到粗品2；(d)将粗品2纯化，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得抗生素FusaricidinA。本发明专利技术首次采用牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333进行发酵制得抗生素FusaricidinA，披露了牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333具有发酵麸皮培养基生成抗生素FusaricidinA的新用途。

Method for preparing antibiotic FusaricidinA

The invention discloses a method for preparing a FusaricidinA antibiotic, which comprises the following steps: (a) the bovine Bacillus CGMCC No.8333 inoculated wheat bran medium for fermentation medium, fermentation liquid; (b) the fermentation liquid centrifugal supernatant, inactivated protease, after cooling, extraction from n-butanol phase and the removal of the organic phase, get the crude 1; (c) the 1 crude separation, collection of antibacterial activity components, freeze drying, get the crude 2; (d) the crude product 2 purification, antibacterial activity of collected fractions, freeze drying, antibiotics FusaricidinA. The invention adopts the bovine Bacillus CGMCC No.8333 fermentation of antibiotics FusaricidinA for the first time, the disclosure of the bovine Bacillus CGMCC No.8333 with new use of fermented wheat bran medium production of antibiotic FusaricidinA.

【技术实现步骤摘要】
一种抗生素FusaricidinA的制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种抗生素FusaricidinA的制备方法。
技术介绍
抗生素(antibiotic)是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。抗生素的特点有：(1)直接作用于菌体细胞。抗生素能选择性地作用于菌体细胞DNA、RNA和蛋白质合成系统的特定环节，干扰细胞的代谢作用，妨碍生命活动或使停止生长，甚至死亡。(2)具有选择性抗生谱。不同抗生素对不同病原菌的作用不一样，对某种抗生素敏感的病原菌种类称为该抗生素的抗生谱(抗菌谱)，这一点不同于无选择性的普通消毒剂或杀菌剂。(3)有效作用浓度低。各种抗生素一般都在很低浓度下对病原菌就发生作用，这是抗生素区别于其他化学杀菌剂的又一主要特点。各种抗生素对不同微生物的有效浓度各异，通常以抑制微生物生长的最低浓度作为抗生素的抗菌强度，简称有效浓度。有效浓度越低，表明抗菌作用越强。Fusaricidins类抗生素是由6个氨基酸残基和1个15-胍基-3-羟基十五烷酸(GHPD)组成的环状多肽类抗生素，分子量大都是900Da左右。自20世纪90年代至今，从多粘类芽孢杆菌中分离出的fusaricidins类抗生素主要有LI-F03、LI-F04、LI-F05、LI-F06、LI-F07、LI-F08以及fusaricidinsA、B、C、D。各种fusaricidins类抗生素结构基本相同，具有相同的侧链，只是氨基酸残基有所不同。结构上的类似使得它们具有相同或相近的生物活性，即对革兰氏阳性菌和植物病原真菌有很好的抗菌效果。中国专利申请CN103740618A公开了类芽孢杆菌属的一个新菌种(后被定名为牛类芽孢杆菌，Paenibacillusbovis)，并将其中的模式菌株BD3526于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，该菌株的保藏编号为：CGMCCNo.8333，该菌株的菌落非常粘稠，表明该菌株具有高产胞外多糖的生理特性。此外，中国专利申请CN104757544A和CN104762350A公开了该菌株具有代谢天然培养基产抑菌性物质的能力及其应用，但并未揭示代谢产物中发挥抑菌作用的明确组分。纵览有关抗生素FusaricidinA的报道，发现其来源相对狭窄，无一例外地均产自多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)，导致这类抗生素来源不足。其次，从培养基角度来看，前期的报道皆采用化学合成培养基，这将直接影响目标物FusaricidinA制备的成本和使用的安全性。上述这些都是本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现思路
基于上述技术问题，本专利技术提供了一种抗生素FusaricidinA制备的新方法，以牛类芽孢杆菌CGMCCNo.8333为发酵菌株，以麸皮培养基作为培养介质，发酵制得抗生素FusaricidinA。具体地，提供了一种抗生素FusaricidinA的制备方法，包括以下步骤：(a)将牛类芽孢杆菌(Paenibacillusbovis)CGMCCNo.8333接种于麸皮培养基中进行发酵，得到发酵液；(b)将步骤(a)得到的发酵液离心取上清，置于高温水浴中灭活蛋白酶，待冷却后，加入正丁醇萃取，离心取正丁醇相，除去正丁醇，加水溶解，冷冻干燥，得到粗品1；(c)将步骤(b)得到的粗品1通过凝胶柱分离，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得到粗品2；(d)将步骤(c)得到的粗品2通过HPLC纯化，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，即得抗生素FusaricidinA。进一步地，上述步骤(a)中，牛类芽孢杆菌CGMCCNo.8333的接种量为1.6x106～8x106cfu/mL。进一步地，上述步骤(a)中，麸皮培养基包括麸皮和水，麸皮占麸皮培养基的质量百分比为2～6％。进一步地，上述步骤(a)中，发酵为振荡培养，振荡速度为100～300rpm。进一步地，上述步骤(a)中，发酵的温度为25℃～35℃。进一步地，上述步骤(a)中，发酵的时间为48～96h。进一步地，上述步骤(b)中，离心的速度为6,000～10,000g，离心的时间为10～20分钟。进一步地，上述步骤(b)中，高温水浴的温度为60～80℃，保温时间为10～30分钟。进一步地，上述步骤(b)中，正丁醇加入量为发酵液体积的0.5～2倍，萃取次数为3～5次，每次萃取静置的时间为8～16h。进一步地，上述步骤(c)中，凝胶柱为LH20凝胶柱，规格为D2.6cm×30cm，分离条件包括：以体积比为3的甲醇-水溶液进行等度洗脱，洗脱速度为2mL/min，洗脱液的收集速度为2.5min/管。进一步地，上述步骤(d)中，HPLC采用的色谱柱为C18柱，规格为SunfireC18柱，20mm×250mm，粒径5μm，分离条件包括：以含0.1％TFA的水作为A相，含0.1％TFA的乙腈作为B相进行梯度洗脱，洗脱速度为4mL/min，洗脱液的收集速度为1.5min/管。收集保留时间在21.2min的组分，即可得到抗生素FusaricidinA。上述技术方案中的制备方法，首次采用牛类芽孢杆菌(Paenibacillusbovis)CGMCCNo.8333，以麸皮培养基作为培养介质进行发酵，并经过离心、萃取，凝胶柱分离、HPLC纯化、冷冻干燥，制备得到抗生素FusaricidinA，披露了牛类芽孢杆菌CGMCCNo.8333具有发酵麸皮培养基生成抗生素FusaricidinA的新用途，拓宽了抗生素FusaricidinA的来源。同时，纯天然、廉价的麸皮培养基，避免使用化学合成培养基，令制得的抗生素FusaricidinA具有更高的使用安全性、更低的制备成本。生物材料保藏信息：本专利技术提供的类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)BD3526菌株，已于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCCNo.8333。附图说明图1为本专利技术实施例1中粗品1在LH20凝胶柱上的分离效果。图2为本专利技术实施例1中粗品1在LH20凝胶柱上分离后点种法检测抑菌活性的效果。图3为本专利技术实施例1中粗品2在HPLC上的纯化效果。图4为本专利技术实施例1中抑菌活性组分的ESI-MS图谱。图5为本专利技术实施例1中抑菌活性组分的二级质谱图。具体实施方式为更清楚的对本专利技术技术方案予以阐述，下面将结合具体实施方式对本专利技术的技术方案进行进一步阐述：在面临“如何拓宽抗生素FusaricidinA的来源，且避免使用化学合成培养基”这一技术问题时，专利技术人经过创造性劳动，提供一种抗生素FusaricidinA的制备方法，包括以下步骤：(a)将牛类芽孢杆菌(Paenibacillusbovis)CGMCCNo.8333接种于麸皮培养基中进行发酵，得到发酵液；(b)将步骤(a)得到的发酵液离心取上清，置于高温水浴中灭活蛋白酶，待冷却后，加入正丁醇萃取，离心取正丁醇相，除去正丁醇，加水溶解，冷冻干燥，得到粗品1；(c)将步骤(b)得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗生素FusaricidinA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333接种于麸皮培养基中进行发酵，得到发酵液；(b)将步骤(a)得到的发酵液离心取上清，置于高温水浴中灭活蛋白酶，待冷却后，加入正丁醇萃取，离心取正丁醇相，除去正丁醇，加水溶解，冷冻干燥，得到粗品1；(c)将步骤(b)得到的粗品1通过凝胶柱分离，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得到粗品2；(d)将步骤(c)得到的粗品2通过HPLC纯化，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得到抗生素FusaricidinA。

【技术特征摘要】
1.一种抗生素FusaricidinA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)将牛类芽孢杆菌(Paenibacillusbovis)CGMCCNo.8333接种于麸皮培养基中进行发酵，得到发酵液；(b)将步骤(a)得到的发酵液离心取上清，置于高温水浴中灭活蛋白酶，待冷却后，加入正丁醇萃取，离心取正丁醇相，除去正丁醇，加水溶解，冷冻干燥，得到粗品1；(c)将步骤(b)得到的粗品1通过凝胶柱分离，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得到粗品2；(d)将步骤(c)得到的粗品2通过HPLC纯化，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得到抗生素FusaricidinA。2.根据权利要求1所述的抗生素FusaricidinA的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述牛类芽孢杆菌CGMCCNo.8333的接种量为1.6x106～8x106cfu/mL。3.根据权利要求1所述的抗生素FusaricidinA的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述麸皮培养基包括麸皮和水，麸皮占麸皮培养基的质量百分比为2～6％。4.根据权利要求1所述的抗生素FusaricidinA的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述发酵为振荡培养，振荡速度为100～300rpm；所述发酵的温度为25℃～35℃；所述发酵的时间为48～96h。5.根据权利要求1所述的抗生素FusaricidinA的制备方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩瑨，刘振民，吴正钧，花榜清，冯华峰，
申请(专利权)人：光明乳业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31