突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白(rhizavidin)及其应用。根据野生型rhizavidin蛋白与生物素结合的分子机理，设计并筛选了能够与生物素可逆结合的突变rhizavidin蛋白，包括Tyr41Phe/Asn43Gln双突变rhizavidin以及Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizavidin。所述突变rhizavidin蛋白可以与生物素或生物素化的生物分子可逆结合，偶联有这种突变rhizavidin蛋白的亲和层析树脂可捕获生物素化的生物分子，而被捕获的生物素化的生物分子可在温和的生理条件下用游离生物素竞争洗脱下来，从而达到纯化目的。

Mutant Phaseolus vulgaris Rhizobium avidin protein and uses thereof

The invention discloses a mutant Phaseolus vulgaris Rhizobium avidin protein (rhizavidin) and uses thereof. According to the molecular mechanism of wild-type rhizavidin protein with biotin binding, design and screening of mutant rhizavidin protein can combine with biotin reversible, including Tyr41Phe/Asn43Gln and rhizavidin double mutant Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys three mutation rhizavidin. The molecular biological reversible mutant rhizavidin protein with biotin or a biotin binding, coupled with the mutant rhizavidin protein affinity chromatography resin can capture biotinylated biomolecules, and biological molecules captured biotinylated in physiology under a mild condition with free biotin competitive elution. In order to achieve the purpose of purification.

【技术实现步骤摘要】
突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白及其应用
本专利技术属于生物分离纯化
，具体涉及一种能够与生物素可逆结合的突变菜豆根瘤菌亲和素蛋白(rhizavidin)、偶联有这种突变蛋白的亲和层析树脂，以及利用这种亲和层析树脂从复杂生物样本中纯化生物素化的生物分子的方法。
技术介绍
亲和素蛋白家族(avidinfamily)是一类在结构和功能上高度相似的蛋白的统称，其中发现最早且最广为人知的是源于鸡蛋清的亲和素(avidin)以及源于阿维丁菌(Streptomycesavidinii)的链霉亲和素(streptavidin)。近十余年来，归功于生物信息学的发展，一些具有不同来源的蛋白也被鉴定为亲和素蛋白家族的成员，包括源于慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)的bradavidin(NordlandH.R.etal.,J.Biol.Chem.2005,280:13250-13255)、源于热带爪蟾(Xenopustropicalis)的xenavidin(J.etal.,BMCStruct.Biol.,2009,9:63)、源于伯克霍尔德菌(Burkholderiapseudomallei)的burkavidin(SardoA.etal.,ProteinExpressionandPurification,2011,77:131-139)、源于Tamogitake蘑菇的tamavidin(TakakuraY.etal.,FEBSJ.,2009,276:1383-1397)、源于菜豆根瘤菌(RhizobiumetliCFN42)共生质粒p42d的rhizavidin(HelppolainenS.H.etal.,Biochem.J.,2007,405:394-405)、源于脱硝希瓦氏菌(Shewanelladenitrificans)的shwanavidin(MeirA.etal.,J.Biol.Chem.,2012,287:17951-17962)以及源于光养赫夫勒氏菌(Hoefleaphototrophica)的hoefavidin(AvrahamO.etal.,J.Struct.Biol.,2015,191:139-148)。其中，最后三种亲和素类蛋白是由两个相同的亚基构成，而其他的亲和素类蛋白则由四个相同的亚基构成。虽然来源迥异，氨基酸序列也各有不同，但所有的亲和素家族蛋白，其亚基的三级结构都具有由8条反平行β-折叠形成的特征性的β-桶状结构(β-barrel)。亲和素家族蛋白在结构上的相似性决定了其功能的相似性。此处所谓功能相似性，意指所有已知的亲和素家族蛋白，其每个亚基的β-桶状结构内部都可结合一个生物素分子。相应的，含两个亚基或四个亚基的亲和素家族蛋白分别可结合两个或四个生物素分子。生物素，又名辅酶R、维生素H和维生素B7，是一个含戊酸侧链的分子量为244.3Dalton的有机小分子。通过对戊酸侧链羧基的化学修饰，生物素可被制作成具有不同反应活性的各种衍生物，如生物素-马来酰亚胺酯和生物素-琥珀酰亚胺酯等，这些衍生物统称为生物素化试剂。具有不同反应活性的生物素化试剂可以和生物分子(蛋白、脂肪、核酸、多糖等)上不同的基团如氨基、巯基、羟基、羧基等反应，从而可以给几乎所有的生物分子标记上生物素，而标记到生物分子上的生物素依然能够与亲和素家族蛋白结合。在生物分子上标记生物素的过程称作生物素化(biotinylation)，相应的，标记有生物素的生物分子称作生物素化的生物分子(biotinylatedbiomolecules)。生物素化的生物分子常作为探针或报告分子用于对样品中特定靶分子的分析，在生物医药研究中具有广泛的应用。亲和素家族蛋白与生物素的结合极为牢固，是已知的最为牢固的非共价键结合之一。例如，亲和素或链霉亲和素与生物素之间形成的复合物，其解离常数Kd为10-14～10-15M，因此在温和的生理条件下被看作是几乎不可逆的结合(温和的生理条件意指不会导致生物分子结构和功能受到破坏的条件，如适宜的温度、接近中性的pH值、不含或只含很低浓度的表面活性剂和变性剂等)。这一特质，以及生物素化试剂的广泛商业来源，使得亲和素/链霉亲和素-生物素系统在各种涉及生物分子分析及检测的技术平台得以广泛应用，如流式细胞分析、荧光显微镜术、酶联免疫吸附、蛋白印迹杂交、基因芯片、蛋白芯片以及纳米生物技术等。另一方面，亲和素家族蛋白与生物素之间结合的不可逆性也限制了其在某些生物医学研究中的应用，尤其是在利用(链霉)亲和素-生物素系统对生物分子进行分离纯化方面。虽然市场上有很多偶联有亲和素或链霉亲和素的亲和层析树脂产品，可用来有效捕获生物素化的生物分子，然而为了进一步将被捕获的生物素化的生物分子从这些亲和层析树脂上洗脱或释放下来，通常需要高温加热(TongX.&SmithL.M.,Anal.Chem.1992,64:2672-2677)，或联合使用高浓度变性剂和极端酸性条件如6～8M盐酸胍和pH1.5(BodanszkyA.&BodanszkyM.,Experientia,1970,26:327)。在这些苛刻的条件下，被捕获的生物分子(尤其是像抗体和酶等蛋白质类生物分子)的高级结构和功能基本上被破坏殆尽。如何在温和的生理条件下实现亲和素家族蛋白与生物素的可逆结合，从而在不影响被捕获的生物素化生物分子结构和功能的前提下将其释放，成了一个受到广泛关注的问题。已有若干方法被尝试用来解决这个问题。第一种方法是使用生物素的结构类似物来代替生物素对生物分子进行标记，如脱硫生物素(desthiobiotin)和2-亚氨基生物素(2-iminobiotin)等。脱硫生物素或脱硫生物素标记的生物分子可以与(链霉)亲和素结合，但与(链霉)亲和素的亲和力显著低于生物素与(链霉)亲和素的亲和力(GreenN.M.,Adv.ProteinChem.,1975,29:85-133；FlorinE.L.etal.,Science,1994,264:415-417)。因此，在与(链霉)亲和素结合后，它们能够被游离的生物素竞争取代，从而得以释放。然而，与生物素化试剂相比，脱硫生物素化试剂的种类及商品化产品来源极为有限且价格非常昂贵，限制了这种方法的普遍应用。2-亚氨基生物素或2-亚氨基生物素标记的生物分子同样可与(链霉)亲和素可逆结合，但结合-解离过程依赖于pH的变化，即结合需在pH＝11的强碱性条件下进行，而解离需在pH＝4的酸性条件下进行(Fudem-GoldinB.&OrrG.A.,MethodsEnzymol.,1990,184:167-173)。相对极端的pH条件对许多生物分子的结构和功能也会造成程度不等的破坏。第二种方法是使用可切割的生物素化试剂，如含有二硫键的生物素化试剂，使用这种生物素化试剂标记的生物分子在与(链霉)亲和素结合后，可以用还原剂破坏二硫键，从而将结合的生物分子释放下来(ShimkusM.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,pp.2593-2597,1985)(专利US4772691)。然而，对于很多本身就含有二硫键的蛋白质如抗体而言，还原剂的使用会本文档来自技高网...

【技术保护点】
突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白，其特征在于：该亲和素蛋白的亚基是将野生型菜豆根瘤菌亲和素蛋白中与生物素咪唑酮环上的羰基氧形成氢键的Tyr突变为Phe以及将与生物素咪唑酮环上仲氨基氢原子形成氢键的Asn突变为Gln而得到的。

【技术特征摘要】
1.突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白，其特征在于：该亲和素蛋白的亚基是将野生型菜豆根瘤菌亲和素蛋白中与生物素咪唑酮环上的羰基氧形成氢键的Tyr突变为Phe以及将与生物素咪唑酮环上仲氨基氢原子形成氢键的Asn突变为Gln而得到的。2.根据权利要求1所述突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白，其特征在于：所述突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白还包括在该亲和素蛋白的亚基间引入的至少一个二硫键。3.根据权利要求2所述突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白，其特征在于：所述二硫键形成于两亚基间界面上的Cys之间，该Cys由突变得到。4.根据权利要求1所述突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白，其特征在于：所述野生型菜豆根瘤菌亲和素蛋白的亚基包括β-桶状结构以及位于该亚基的羧基端且游离于β-桶状结构之外的卷曲或自羧基端对构成该卷曲的氨基酸序列进行截短后剩余的部分。5.根据权利要求4所述突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白，其特征在于：所述截短后剩余的部分至少包括一个Lys。6.突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白，其特征在于：该亲和素蛋白的亚基具有如SEQ.ID.NO.3或SEQ.ID.NO.4所示的氨基酸序列，或者，该亲和素蛋白的亚基由氨基酸序列为SEQ.ID.NO.2的野生型菜豆根瘤菌亲和素蛋白的亚基突变得到，突变位点分别为自SEQ....

【专利技术属性】
技术研发人员：张毅奕，
申请(专利权)人：西安亚博生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61