一种用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术属于医学检验技术领域，具体涉及一种用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒及其检测方法。本发明专利技术提供的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒包括雌激素受体标准品，雌激素受体质控品，浓缩洗涤液，发光底物溶液Ⅰ，发光底物溶液Ⅱ，抗试剂和磁珠免疫复合物。本发明专利技术提供的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒具有检测时间短、用量少、灵敏度高、特异性强、高重复性等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒及其检测方法
本专利技术属于医学检验
，具体涉及一种用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
结直肠癌，又称大肠癌，是常见的恶性消化道肿瘤之一，危害着全球人类的健康。在男性恶性肿瘤中发病率位居第三位，在女性中位居第二位。流行病学和生物学研究发现，无论在大肠癌的发病率还是病理发展过程中，均存在着性别差异。研究证明，性激素，特别是雌激素可能是其中的一个重要的调节因素。具有相似分期和病理类型的男性大肠癌病人和女性大肠癌病人，其肿瘤的发生和进展却有明显不同。而且，改变体内的激素微环境水平，可以减缓或促进肿瘤的发生及进展，有许多研究论证了这个观点，尤其是来自雌激素替代疗法等方面的临床研究，而雌激素在体内主要依靠雌激素受体结合发挥生物作用的。雌激素是由芳香化酶催化雄激素转化而来的，影响其靶组织(生殖系统、脑与心血管系统等)的生长、分化和功能。近年来的研究发现，雌激素在大肠癌的发生中起一种保护性作用。雌激素替代治疗可以减少妇女发生大肠癌的风险，并且可以减少女性大肠癌患者的死亡率。大肠癌的发生发展与雌激素有关。雌激素主要是通过雌激素受体发挥生物学作用的。雌激素受体属于核受体超家族成员，是一类配体调节的转录因子，通过与不同配体和反应元件结合，调节一系列靶基因转录，进而发挥生物学作用。目前，大肠癌的筛查包括侵入性和非侵入性两种主要手段。目前，侵入性检查主要指肠镜检查，虽然肠镜可以明显的提高大肠癌的检测率，但是，这种检测方法因为高成本，高风险，操作麻烦而限制了它从而不能成为大肠癌的普查方法，而非侵入性的生物分子标志具有方便容易以及经济等优点，因此他们在大肠癌的普查中具有很大的优势及潜力。生物标志物是生物体内状态的提示物，因此，生物分子标志物拥有评估正常生物过程、病理过程以及体内对药物治疗的反应。而作为检测大肠癌的生物标志最关键的一点就是它必须是大肠癌早期的反应指标，这样才能早期发现早期治疗大肠癌。所以大肠癌检测方法必须要有很高的灵敏度和特异度，而假阳性率和假阴性率都要相对很低，以至于不会让正常人群免去做肠镜的痛苦。中国专利申请CN102747151A公开了一种检测雌激素受体α基因上游TA重复序列的试剂盒及检测方法，它包括红细胞裂解液、核酸提取液、PCR扩增反应液，酶纯化液。中国专利申请CN102329875A公开了一种猪雌激素受体基因快速分型试剂盒，其试剂包括引物预混液、HRMPCR预混液和Nuclease-freedH2O。目前，有许多非侵入性大肠癌的检测方法，其中FOBT是目前最常用的方法。但是，这种方法在筛查普通人群时灵敏度和特异度方面欠缺。因此，研究出一种灵敏度和特异度高的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，更好的提高大肠癌检出率，以及判断被诊断患大肠癌的患者的预后和治疗有效性是必要的。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒及其检测方法。本专利技术提供的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒具有检测时间短、用量少、灵敏度高、特异性强、高重复性等优点。本专利技术的技术方案是：本专利技术提供了一种用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，所述试剂盒包括雌激素受体标准品，雌激素受体质控品，浓缩洗涤液，发光底物溶液Ⅰ，发光底物溶液Ⅱ，抗试剂和磁珠免疫复合物。所述雌激素受体标准品的制备包括以下步骤：用含有体积分数为5％BSA、体积分数为0.1％硫柳汞的pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液，将雌激素受体配制成浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、45ng/mL、90ng/mL、200ng/mL的标准液，即得。所述雌激素受体质控品的制备包括以下步骤：雌激素受体质控品的制备包括以下步骤：用含有体积分数为5％BSA、体积分数为0.1％硫柳汞的pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液，将雌激素受体配制成浓度分别为60ng/mL、120ng/mL的溶液，即得。所述浓缩洗涤液的制备方法为：向pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液中加入Tween-20，使Tween-20的体积分数为5％。所述发光底物液Ⅰ的制备方法为：用双蒸水和硝酸配制成浓度为0.1M的稀硝酸溶液，加入过氧化氢，使过氧化氢的浓度为0.08M。所述发光底物液Ⅱ的制备方法为：用双蒸水和氢氧化钠配制成浓度为0.2M的氢氧化钠溶液，加入TritonX-100，使TritonX-100的质量浓度为2％。所述抗试剂的制备包括以下步骤：(1)取雌激素受体单克隆抗体，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液调整雌激素受体单克隆抗体的浓度为1mg/mL，得溶液A；(2)取吖啶酯，加入二甲基甲酰胺使吖啶酯的浓度至2mg/mL，得溶液B；(3)将步骤(2)所得溶液B加入到步骤(1)所得溶液A中，吖啶酯与雌激素受体单克隆抗体的摩尔比为15～25∶1，室温反应，反应时间为20～40min，得反应液；(4)将步骤(3)所得反应液移至截留分子量为7000～10000的透析袋内，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液透析24h，加入与上述反应液等体积的甘油，置-25℃保存，即得。所述磁珠免疫复合物的制备包括以下步骤：取100μL浓度为10mg/mL的链霉亲和素磁珠，用250μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤3～5次，加入40μL生物素化雌激素受体单克隆抗体，置于37℃恒温气浴摇床中振荡，振荡速度为120r/min，8～20min后取出，用200μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤4次，然后，重新置于上述恒温气浴摇床中，加入1mL含体积分数为2％BSA的pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液进行封闭反应，封闭反应时间为10～25min，取出，磁性分离，去上清，用200μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤4次，加入pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液配成1mg/mL的磁珠免疫复合物，置于4℃避光保存，即得；其中，所述浓缩洗涤液的制备方法为：向pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液中加入Tween-20，使Tween-20的体积分数为5％。其中，上述磁珠免疫复合物的制备中，所述生物素化雌激素受体单克隆抗体的制备包括以下步骤：A取雌激素受体单克隆抗体，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液调整雌激素受体单克隆抗体的浓度为1mg/mL，得溶液Ⅰ；B将生物素、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶于二甲基甲酰胺中，生物素、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1∶1.2，于50℃水浴中磁力搅拌反应，反应时间为12h，滤去反应液中生成的白色沉淀二环己基脲，收集滤液，加入乙醚至沉淀不再增加，置于冰浴中，放置时间为1h，过滤收集沉淀，得活性生物素酯粗品，将上述活性生物素酯粗品用热异丙醇溶解，置于冰浴中，放置时间为3h，过滤收集结晶，用二甲基甲酰胺溶解后加入乙醚，置于冰浴中，放置时间为1h，过滤收集沉淀，真空干燥，得活性生物素酯；C向步骤A所得溶液Ⅰ中加入步骤B所得活性生物素酯，活性生物素酯与雌激素受体单克隆抗体的摩尔比为8～15∶1，室温反应，反应时间为20～40min，得反应液；D将步骤C所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括雌激素受体标准品，雌激素受体质控品，浓缩洗涤液，发光底物溶液Ⅰ，发光底物溶液Ⅱ，抗试剂和磁珠免疫复合物。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括雌激素受体标准品，雌激素受体质控品，浓缩洗涤液，发光底物溶液Ⅰ，发光底物溶液Ⅱ，抗试剂和磁珠免疫复合物。2.如权利要求1所述的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，其特征在于，所述雌激素受体标准品的制备包括以下步骤：用含有体积分数为5％BSA、体积分数为0.1％硫柳汞的pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液，将雌激素受体配制成浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、45ng/mL、90ng/mL、200ng/mL的标准液，即得。3.如权利要求1所述的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，其特征在于，所述雌激素受体质控品的制备包括以下步骤：用含有体积分数为5％BSA、体积分数为0.1％硫柳汞的pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液，将雌激素受体配制成浓度分别为60ng/mL、120ng/mL的溶液，即得。4.如权利要求1所述的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液的制备方法为：向pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液中加入Tween-20，使Tween-20的体积分数为5％；所述发光底物液Ⅰ的制备方法为：用双蒸水和硝酸配制成浓度为0.1M的稀硝酸溶液，加入过氧化氢，使过氧化氢的浓度为0.08M；所述发光底物液Ⅱ的制备方法为用双蒸水和氢氧化钠配制成浓度为0.2M的氢氧化钠溶液，加入TritonX-100，使TritonX-100的质量浓度为2％。5.如权利要求1所述的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，其特征在于，所述抗试剂的制备包括以下步骤：(1)取雌激素受体单克隆抗体，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液调整雌激素受体单克隆抗体的浓度为1mg/mL，得溶液A；(2)取吖啶酯，加入二甲基甲酰胺使吖啶酯的浓度至2mg/mL，得溶液B；(3)将步骤(2)所得溶液B加入到步骤(1)所得溶液A中，吖啶酯与雌激素受体单克隆抗体的摩尔比为15～25∶1，室温反应，反应时间为20～40min，得反应液；(4)将步骤(3)所得反应液移至截留分子量为7000～10000的透析袋内，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液透析24h，加入与上述反应液等体积的甘油，置-25℃保存，即得。6.如权利要求1所述的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠免疫复合物的制备包括以下步骤：取100μL浓度为10mg/mL的链霉亲和素磁珠，用250μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤3～5次，加入40μL生物素化雌激素受体单克隆抗体，置于37℃恒温气浴摇床中振荡，振荡速度为120r/min，8～20min后取出，用200μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤4次，然后，重新置于上述恒温气浴摇床中，加入1mL含体积分数为2％BSA的pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液进行封闭反应，封闭反应时间为10～25min，取出，磁性分离，去上清，用200μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤4次，加入pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液配成1mg/mL的磁珠免疫复合物，置于4℃避光保存，即得；其中，所述浓缩洗涤液的制备方法为：向pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液中加入Tween-20，使Tween-20的体积分数为5％。7.如权利要求6所述的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，其特征在于，所述生物素化雌激素受体单克隆抗体的制备包括以下步骤：A取雌激素受体单克隆抗体，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液调整雌激素受体单克隆抗体的浓度为1mg/mL，得溶液Ⅰ；B将生物素、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶于二甲基甲酰胺中，生物素、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1∶1.2，于50℃水浴中磁力...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈立国，邹伟权，张亚丽，李庆祥，母润红，王涛，苏焱，
申请(专利权)人：广州华弘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44