人抗苗勒氏管激素的流式检测试剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了人抗苗勒氏管激素的流式检测试剂及其制备方法和应用，特点是该试剂包括用于检测人血清或血液中抗苗勒管激素含量的抗体Ab1‑微球偶联物和抗体Ab2‑荧光分子标记物，其制备方法步骤包括针对人抗苗勒管激素单克隆抗体的制备和配对，人抗苗勒管激素单克隆抗体与载体微球的偶联以及单克隆抗体的荧光分子标记，优点是根据荧光值的强弱直接判断AMH含量的高低，只需往试剂中添加血液样本，就能得到实验结果，简化了检测过程中的实验操作步骤，同时配合自动加样系统，就可实现高通量多样本的连续检测，极大的提高了检测的效率，检测的灵敏度可达到0.01ng/ml。

【技术实现步骤摘要】
人抗苗勒氏管激素的流式检测试剂及其制备方法和应用
本专利技术涉及血清或血浆中抗苗勒氏管激素含量的检测技术，尤其是涉及一种人抗苗勒氏管激素的流式检测试剂及其制备方法和应用。
技术介绍
抗苗勒氏管激素(anti-Mullerianhormone，AMH)是转化生长因子β超家族的成员之一，由ProfessorAlfredJost首先发现。AMH是由两个相同的70×103Da亚基，通过二硫键连接组成的二聚糖蛋白，相对分子质量为140×103Da；人类AMH编码基因位于19号染色体短臂，大小2.4～2.8kb，含有5个外显子。抗苗勒氏管激素(AMH)在性腺器官发育过程中起着重要作用，是男女性腺功能的重要标记物之一。在男性中AMH主要由睾丸间质细胞产生，始于胚胎形成并贯穿生命始终；在男性胎儿的发育过程中，AMH导致苗勒氏管退化，形成正常发育的男性生殖管道。在女性中AMH主要由卵巢颗粒细胞产生，血清AMH保持相对于男性较低的一个水平，从青春期开始，血清AMH水平随时间慢慢降低，并在更年期降低。AMH是由卵巢窦前卵泡和小窦状卵泡颗粒细胞分泌的活性因子，不受促性腺激素(Gn)的反馈调节，可抑制卵泡的募集和选择，在始基卵泡上无表达，在初级卵泡的颗粒细胞上弱表达，在≤4mm的小窦卵泡中强表达，而在＞4mm窦卵泡中表达逐渐减弱至完全消失。抑制卵泡生长，参与了卵泡形成的两个重要调控，始基卵泡募集和周期募集。较其它卵巢评价指标更能准确地反映育龄期女性机体内分泌状态。人体内，AMH的平均半衰期为(27.6±0.8)h，完全清除约需8d。正常生育期女性血清AMH与年龄呈负相关，在0.43～43.19pmol/L间波动，峰值处于18～25岁，36岁后显著下降，41～47岁时降至8.0pmol/L，各个年龄段AMH的正常参考范围均较大。随着AMH的作用被越来越多人所熟知，AMH逐步被应用于妇科内分泌疾病、生殖医学领域、性别异常等范畴。多囊卵巢综合征(PCOS)是一种生殖功能障碍和糖代谢异常并存的内分泌紊乱综合征，存在于5％～10％的育龄期女性中，主要表现为稀少排卵或不排卵、闭经、不孕，卵巢多囊样改变、高雄激素和高胰岛素血症。AMH水平与PCOS的诊断和管理有潜在相关性。血清AMH可预测卵巢功能减退及绝经年龄。卵巢功能减退指卵巢产生卵母细胞的能力降低，卵泡质量下降，进一步可发展为卵巢早衰(POF)，严重影响女性生殖能力。POF患者血清AMH水平相当于绝经期妇女AMH水平，在绝经前5年开始，逐渐降低，故认为血清AMH可以预测绝经年龄。POF患者的窦前卵泡存在缺陷，分泌AMH低，低AMH水平加速原始卵泡的募集，形成恶性循环，使原始卵泡库存提早衰竭。POF患者窦卵泡闭锁或者黄素化，导致AMH低表达，可能与颗粒细胞凋亡有关。胎儿性器官分化与AMH密切相关，男性睾丸的发育和功能与AMH亦有关，AMH的检测可以帮助分辨隐睾症、单睾症、持续性苗勒管综合征(PMDS)等。有研究不断证实AMH是预测卵巢功能的最佳血清学指标，联合窦卵泡数(AFC)和FSH时更为准确。然而，随着AMH应用的广泛深入，对其实验室检测也提出了更高的要求，且目前尚存以下一些亟待解决的问题：(1)目前尚无统一的AMH检测标准和校正衡量值；(2)由于检测技术的原因，各实验室检测值波动较大；这为新的ANH检测技术提供的研发方向和应用前景。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种准确快速的人抗苗勒管激素的流式检测试剂及其制备方法和应用，该流式检测试剂可有效检测人血清或血液中的抗苗勒管激素，检测的灵敏度可达到0.01ng/ml。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：1、一种人抗苗勒管激素的流式检测试剂，包括用于检测人血清或血液中抗苗勒管激素含量的抗体Ab1-微球偶联物和抗体Ab2-荧光分子标记物，其中抗体微球偶联物的结构通式如图1所示，其中M为高分子材料制成的单分散微球，R为功能结合键，Ab1为AMH单克隆抗体1；所述的抗体荧光分子标记物的结构通式如图2所示，其中Ab2为AMH单克隆抗体2，F为荧光分子。所述的抗体Ab1和Ab2为成熟AMH蛋白片段免疫小鼠所制备的AMH单克隆抗体对，所述的抗体Ab1和Ab2能同时与AMH抗原结合，所述的成熟AMH蛋白片段的氨基酸序列如下：SAGATAADGPCALRELSVDLRAERSVLIPETYQANNCQGVCGWPQSDRNPRYGNHVVLLLKMQARGAALARPPCCVPTAYAGKLLISLSEERISAHHVPNMVATECGCR。所述的AMH单克隆抗体对是从20个鼠源AMH单克隆抗体库中利用十字交叉法筛选配对得到的配对效果最佳一对抗体。所述的单分散微球的直径为3-30微米，材质为聚苯乙烯(PS)或二氧化硅(SiO2)，所述的单分散微球的外表面功能化修饰有羧基、氨基、羟基或巯基；所述的功能结合键为羧基与氨基结合的酰胺键或者羟基与羧基的结合键或者巯基与羟基的结合键；所述的荧光分子为偶联的荧光染料，所述的荧光染料为异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(APC)、异硫氰酸盐罗丹明B、四甲基异硫氰酸罗丹明或花青染料(Cy2/3/5)。2、上述人抗苗勒管激素的流式检测试剂的制备方法，具体步骤如下：(1)AMH单克隆抗体的制备选取一段成熟AMH蛋白片段序列作为制备抗苗勒管激素抗体库的抗原，将抗原的碱基序列克隆至原核表达载体pET-41a上，E.coli原核表达系统表达出AMH抗原蛋白，用亲和层析的方法纯化带标签的AMH抗原蛋白；所述的成熟AMH蛋白片段的氨基酸序列如下：SAGATAADGPCALRELSVDLRAERSVLIPETYQANNCQGVCGWPQSDRNPRYGNHVVLLLKMQARGAALARPPCCVPTAYAGKLLISLSEERISAHHVPNMVATECGCR；将AMH抗原蛋白用水溶性佐剂接种免疫5只6-8周龄Balb/c品系小鼠，于第一天、第十四天、第二十一天和第三十五天分别进行免疫，采集小鼠第一天和第三十五天的小鼠血清各100uL，ELISA检测血清效价；当效价达到1：50000后，选取血清效价最高的小鼠，拉劲处死，取该小鼠的脾脏，获取脾细胞，然后与小鼠Balb/c品系骨髓瘤细胞sp2/0进行3次融合；在融合24小时后，加HAT选择培养基培养两周，采用96孔板克隆化细胞，筛选出杂交瘤细胞；用ELISA检测克隆培养上清，检测出抗原阳性100-500个阳性细胞，扩大培养至48孔板，挑取阳性克隆扩增，ELISA检测克隆培养上清，根据检测结果，挑选40株效价最高的阳性克隆进行亚克隆化，每个亚克隆做96孔板有限稀释培养，ELISA筛选培养上清，每个母克隆挑选2个阳性亚克隆；阳性克隆扩大培养，ELISA检测上清效价大于1：20000，挑取20个效价最高的克隆做96孔板有限稀释培养，放大培养至T-25Flask培养，培养的上清用proteinA或proteinG纯化即得到纯度达到90％以上的AMH单克隆抗体库；(2)双抗夹心法筛选能够配对的AMH抗体对将20个纯化好的单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记，同时将这20个单克隆抗体包被板，采用十字交叉法检测配对效果，以抗原浓度和标记抗体的量为变量因素，设置本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人抗苗勒管激素的流式检测试剂，其特征在于包括用于检测人血清或血液中抗苗勒管激素含量的抗体Ab1‑微球偶联物和抗体Ab2‑荧光分子标记物，其中抗体微球偶联物的结构通式如图1所示，其中M为高分子材料制成的单分散微球，R为功能结合键，Ab1为AMH单克隆抗体1；所述的抗体荧光分子标记物的结构通式如图2所示，其中Ab2为AMH单克隆抗体2，F为荧光分子。

【技术特征摘要】
1.一种人抗苗勒管激素的流式检测试剂，其特征在于包括用于检测人血清或血液中抗苗勒管激素含量的抗体Ab1-微球偶联物和抗体Ab2-荧光分子标记物，其中抗体微球偶联物的结构通式如图1所示，其中M为高分子材料制成的单分散微球，R为功能结合键，Ab1为AMH单克隆抗体1；所述的抗体荧光分子标记物的结构通式如图2所示，其中Ab2为AMH单克隆抗体2，F为荧光分子。2.根据权利要求1所述的人抗苗勒管激素的流式检测试剂，其特征在于：所述的抗体Ab1和Ab2为成熟AMH蛋白片段免疫小鼠所制备的AMH单克隆抗体对，所述的抗体Ab1和Ab2能同时与AMH抗原结合，其中所述的成熟AMH蛋白片段的氨基酸序列如下：SAGATAADGPCALRELSVDLRAERSVLIPETYQANNCQGVCGWPQSDRNPRYGNHVVLLLKMQARGAALARPPCCVPTAYAGKLLISLSEERISAHHVPNMVATECGCR。3.根据权利要求2所述的人抗苗勒管激素的流式检测试剂，其特征在于：所述的AMH单克隆抗体对是从20个鼠源AMH单克隆抗体库中利用十字交叉法筛选配对得到的配对效果最佳一对抗体。4.根据权利要求1所述的人抗苗勒管激素的流式检测试剂，其特征在于：所述的单分散微球的直径为3-30微米，材质为聚苯乙烯或二氧化硅，所述的单分散微球的外表面功能化修饰有羧基、氨基、羟基或巯基；所述的功能结合键为羧基与氨基结合的酰胺键或者羟基与羧基的结合键或者巯基与羟基的结合键；所述的荧光分子为偶联的荧光染料，所述的荧光染料为异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、藻蓝蛋白、异硫氰酸盐罗丹明B、四甲基异硫氰酸罗丹明或花青染料。5.一种根据权利要求1所述的人抗苗勒管激素的流式检测试剂的制备方法，其特征在于具体步骤如下：(1)AMH单克隆抗体的制备选取一段成熟AMH蛋白片段序列作为制备抗苗勒管激素抗体库的抗原，将抗原的碱基序列克隆至原核表达载体pET-41a上，E.coli原核表达系统表达出AMH抗原蛋白，用亲和层析的方法纯化带标签的AMH抗原蛋白；其中所述的成熟AMH蛋白片段的氨基酸序列如下：SAGATAADGPCALRELSVDLRAERSVLIPETYQANNCQGVCGWPQSDRNPRYGNHVVLLLKMQARGAALARPPCCVPTAYAGKLLISLSEERISAHHVPNMVATECGCR；将AMH抗原蛋白用水溶性佐剂接种免疫5只6-8周龄Balb/c品系小鼠，于第一天、第十四天、第二十一天和第三十五天分别进行免疫，采集小鼠第一天和第三十五天的小鼠血清各100uL，ELISA检测血清效价；当效价达到1：50000后，选取血清效价最高的小鼠，拉劲处死，取该小鼠的脾脏，获取脾细胞，然后与小鼠Balb/c品系骨髓瘤细胞sp2/0进行3次融合；在融合24小时后，加HAT选择培养基培养两周，采用96孔板克隆化细胞，筛选出杂交瘤细胞；用ELISA检测克隆培养上清，检测出抗原阳性100-500个阳性细胞，扩大培养至48孔板，挑取阳性克隆扩增，ELISA检测克隆培养上清，根据检测结果，挑选40株效价最高的阳性克隆进行亚克隆化，每个亚克隆做96孔板有限稀释培养，ELISA筛选培养上清，每个母克隆挑选2个阳性亚克隆；阳性克隆扩大培养，ELISA检测上清效价大于1：20000，挑取20个效价最高的克隆做96孔板有限稀释培养，放大培养至T-25Flask培养，培养的上清用proteinA或proteinG纯化即得到纯度达到90％以上的AMH单克隆抗体库；(2)双抗夹心法筛选能够配对的AMH抗体对将20个纯化好的单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记，同时将这20个单克隆抗体包被板，采用十字交叉法检测配对效果，以抗原浓度和标记抗体的量为变量因素，设置阴性对照，空白对照，如果测定值为阴性值的2.1倍，则表示为阳性，筛选出一对配对效果最佳的抗体对Ab1和Ab2，作为偶联微球和荧光分子的前期材料；(3)AMH单克隆抗体Ab1与微球偶联将碳二亚胺粉末和N-羟基琥珀酰亚胺粉末加入到浓度为1mg/mL的AMH单克隆抗体Ab1溶液中，室温避光反应15分钟，然后向反应溶液中加入浓度为0.5wt％的单分散微球溶液，30℃避光震荡反应4小时，...

【专利技术属性】
技术研发人员：高攀，房海燕，陈继勇，
申请(专利权)人：浙江星博生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33