一种检测萝卜Ogura‑CMS育性恢复基因的高通量分子标记及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测萝卜Ogura‑CMS育性恢复基因Rfo的高通量分子标记及其应用。本发明专利技术所提供的高通量分子标记是用于检测萝卜Ogura‑CMS育性恢复基因Rfo的KASP引物，引物序列是SEQ ID1～3所述的核苷酸序列。本发明专利技术基于萝卜Ogura‑CMS育性恢复基因Rfo的序列设计高通量KASP专用引物，采用PCR SNPLine平台检测Rfo基因的基因型，具有操作流程全自动，通量高，适合大量样品同时检测。本发明专利技术用于萝卜Ogura类型细胞质雄性不育系的转育，可以大大节约时间和人力，提高育种效率。

A detection radish Ogura CMS restorer high-throughput molecular marker gene and its application

The invention discloses a method for detecting the radish Ogura CMS fertility restorer gene Rfo high-throughput molecular marker and its application. High throughput molecular markers provided by the invention is used for detecting Ogura CMS KASP primer radish fertility restorer gene Rfo, primer sequence is SEQ ID1 ~ 3 the nucleotide sequence. The invention of radish Ogura CMS fertility restorer gene Rfo sequence specific primers design Qualcomm KASP based on the genotypes of Rfo gene PCR SNPLine platform, with the process of automatic operation, high flux, suitable for a large number of samples and detection. The invention can be used for the transfer of the radish type Ogura cytoplasmic male sterile line, thereby greatly saving time and manpower, and improving the breeding efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因的高通量分子标记及应用
本专利技术涉及一套检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的KASP标记引物及其应用，属于分子遗传育种

技术介绍
雄性不育系和自交不亲和系是萝卜利用杂种优势的两个主要途径。与自交不亲和系相比，雄性不育系具有两个明显的优势，一是可以提高杂交种的纯度，二是可以避免亲本的流失，从而保证育种家的利益。目前，在萝卜中发现了不同类型的雄性不育细胞质，如Ogura、金花薹48A、Kosena、NWB和DCGMS，其中应用最广泛且研究最深入的是Ogura雄性不育细胞质。细胞质雄性不育系的转育是萝卜杂种优势利用和配制杂交种的关键，传统的回交转育方法费时费力，主要过程包括，获得萝卜Ogura-CMS不育源后，选择多个综合性状优良、配合力好的自交系做父本分别与不育源杂交；淘汰杂交后代全部为可育的自交系；对于杂交后代出现育性分离或全不育的自交系，可作为轮回亲本，以杂交后代或回交后代中的不育株做母本，进行6-7代连续回交，最终获得遗传背景相似的不育系和相应的保持系。从分子水平上来说，萝卜Ogura-CMS属质核互作雄性不育类型，植株育性是由线粒体不育基因orf138和细胞核育性恢复基因orf687(Rfo)相互作用控制的。在不育系中ORF138蛋白在线粒体内膜上积累，干扰其他线粒体基因(atp6、atp8、coxI等)的功能，导致雄性不育的发生。Ogura-CMS的育性可由细胞核内育性恢复基因(Rfo)恢复，该基因编码一种PPR蛋白，包含687个氨基酸，能够阻止花药绒毡层中ORF138蛋白的合成，从而使雄性不育系恢复育性(Desloireetal，2003)。分子标记的开发将极大地提高不育系转育的效率，萝卜Ogura-CMS细胞核育性恢复基因orf687(Rfo)及相应的等位基因(rfo，没有恢复功能)的高效鉴定其中的关键技术。Yasumoto等(2008)根据不育系和恢复系中orf687(Rfo)基因序列差异开发了PCR-RFLP标记，并用于研究恢复基因在日本野萝卜中的分布频率。在此基础上，Sun等(2012)利用该标记应用于萝卜雄性不育系的辅助选择。但PCR-RFLP标记需要结合PCR扩增、限制性内切酶消化和凝胶电泳过程，不但对DNA质量要求较高、经常由于反应条件不稳定造成精确度降低，而且不能实现高通量、大样品的检测。KASP(KompetitiveAlleleSpecificPCR，竞争性等位基因特异性PCR)分型技术，能够对基因组中SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断，具有灵敏度高、高通量、低成本、快速等优点，是目前国际上SNP分析的主流方法之一。因此，本专利技术开发了一种基于KASP分型技术的萝卜Rfo基因SNP分子标记并应用于萝卜雄性不育系的转育。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一套用于检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的KASP专用引物。本专利技术所述的KASP专用引物包括以下3条引物：(1)引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGCTGCAGAAACATTTTATCAGAATG-3’；其由GAAGGTGACCAAGTTCATGCT为标签序列A；(2)引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGCTGCAGAAACATTTTATCAGAATA-3’；其中GAAGGTCGGAGTCAACGGATT为标签序列B；(3)引物3：5’-GAAAGGAAACAGATTCGATGTGATATATACA-3’。更加具体的，引物1为核苷酸序列如序列表中序列1所示的单链DNA；引物2为核苷酸序列如序列表中序列2所示的单链DNA；引物3为核苷酸序列如序列表中序列3所示的单链DNA。本专利技术的目的之二是提供一种用于检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的试剂盒含有所述KASP引物，还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B。在本专利技术中所述荧光探针A、所述荧光探针B、所述淬灭探针A和淬灭探针B是存在于KASPV4.02×MasterMix，其中所述KASPV4.02×MasterMix是英国LGC公司产品，产品目录号为KBS-1016-002，适用于96/384的孔板。本专利技术的目的之三是提供利用KASP标记引物检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的基因型的方法。检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的基因型的方法包括如下步骤：以萝卜基因组DNA为模板，采用所述试剂盒中的KASP引物进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用Kraken软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下所述判定待测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的基因型：若待测萝卜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测萝卜的Rfo基因的基因型为RfRf(SNP分型为A：A基因型)；若所述待测萝卜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测萝卜的Rfo基因的基因型为rfrf(SNP分型为G：G基因型)；若所述待测萝卜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现绿色，则所述待测萝卜的Rfo基因的基因型为Rfrf(SNP分型为A：G基因型)。本专利技术的目的之四是提供利用KASP标记引物辅助选择培育萝卜Ogura类型雄性不育系的方法。本专利技术提供的培育萝卜Ogura类型雄性不育系的方法包括如下步骤：利用已公开的萝卜Ogura-CMS线粒体不育基因orf138筛选获得不含有orf138基因的萝卜单株；利用所述试剂盒中的KASP引物对筛选获得的单株进行育性恢复基因Rfo的基因型鉴定，获得Rfo基因的基因型为rfrf的单株，以萝卜Ogura-CMS不育株为母本，以筛选获得的Rfo基因的基因型为rfrf的单株为父本和轮回亲本，进行连续6-7代回交和轮回亲本自交，即可获得遗传背景一致、稳定遗传的萝卜不育系和相应的保持系。本专利技术的有益效果：本专利技术公开了一种用于检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的高通量分子标记及其应用。本专利技术基于萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的序列设计高通量KASP专用引物，采用PCRSNPLine平台检测Rfo基因的基因型，具有操作流程全自动，通量高，适合大量样品同时检测。本专利技术用于萝卜Ogura类型细胞质雄性不育系的转育，可以大大节约时间和人力，提高育种效率，加速萝卜不育系的转育。附图说明图1、萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo及其等位基因rfo序列比对示意图。图2、利用高通量KASP分子标记分析11份自交系育性恢复基因Rfo的SNP分型结果示意图。其中，NTC表示空白对照(黑色)，？表示由于DNA质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型(粉色)，A：A为红色，A：G为绿色，G：G为蓝色。图3、利用PCR-RFLP标记检测待测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的基因型。图4、利用高通量KASP分子标记分析部分单株恢复基因Rfo的SNP分型结果示意图。其中，NTC表示空白对照(黑色)，？表示由于DNA质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型(本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测萝卜Ogura‑CMS育性恢复基因Rfo的KASP标记专用引物，其特征在于包括：(1)引物1：5’‑

【技术特征摘要】
1.用于检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的KASP标记专用引物，其特征在于包括：(1)引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGCTGCAGAAACATTTTATCAGAATG-3’；其中GAAGGTGACCAAGTTCATGCT为标签序列A。所述引物1为序列表中序列1所示的单链DNA。(2)引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGCTGCAGAAACATTTTATCAGAATA-3’；其中GAAGGTCGGAGTCAACGGATT为标签序列B；所述引物2为序列表中序列2所示的单链DNA。(3)引物3：5’-GAAAGGAAACAGATTCGATGTGATATATACA-3’。所述引物3为序列表中序列3所示的单链DNA。2.用于检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的试剂盒，其特征在于包括：(1)所述试剂盒中含有权利要求1中所述的KASP引物；(2)所述试剂盒中含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；所述荧光探针A的核苷酸序列与权利要求1所述标签序列A的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团FAM；所述淬灭探针A的核苷酸序列与权利要求1所述标签序列A的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团BHQ；所述荧光探针B的核苷酸序列与所述标签序列B的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团HEX；所述淬灭探针B的核苷酸序列与所述标签序列B的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团BHQ。3.权利要求1中所述的KASP引物或权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽，王庆彪，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京,11