野生亚麻种子总DNA提取方法技术

野生亚麻种子总DNA提取方法，它属于植物分子育种学领域。本发明专利技术所述的野生亚麻种子总DNA提取方法，提取缓冲液的配方为每1000ml缓冲液中含有100mmol醋酸钠、50mmol乙二胺四乙酸二钠、500mmol氯化钠、2％聚乙烯吡咯烷酮、1.4％十二烷基磺酸钠。经液氮研磨之后，再用缓冲液研磨，使DNA充分溶于缓冲液中而不被破坏，直接决定了DNA提取的产量更大。而经过过滤的DNA提取缓冲液在提取初期就先去掉一部分果胶质，直接降低了DNA的粘稠度。本发明专利技术步骤简单，实验试剂无毒，提取量大，解决了无法获得或者获取茎叶材料困难的难题，打破DNA提取在时间上限制，只要有种子且需要DNA时，随时可以提取。

Method for extracting total DNA from Wild Flax Seeds

The invention discloses a method for extracting total DNA from wild flax seeds, belonging to the field of plant molecular breeding. The extraction method of the invention comprises the Wild Flax seed total DNA extraction buffer formula for each 1000ml buffer solution containing 100mmol sodium acetate, sodium 500mmol, 50mmol EDTA two sodium chloride, 2% polyvinylpyrrolidone, 1.4% twelve alkyl sodium sulfonate. After being grinded by liquid nitrogen, the DNA is fully dissolved in buffer without being destroyed by using the buffer, so that the yield of DNA extraction is directly determined. The filtered DNA extraction buffer, at the beginning of the extraction, first remove some of the gum, and directly reduce the viscosity of DNA. The invention has the advantages of simple steps, non-toxic reagents, extract a large amount of solution cannot be obtained or acquired problem stems and leaves material difficult to break DNA, extract the time limit, as long as the seed and DNA, can be extracted at any time.

【技术实现步骤摘要】
野生亚麻种子总DNA提取方法
本专利技术属于植物分子育种学领域，具体涉及一种野生亚麻种子总DNA提取方法。
技术介绍
目前植物总DNA提取方法有CTAB法，SDS法，高盐低PH值法等。亚麻总DNA提取常用方法为高盐低PH法，该方法常以茎叶为提取原材料。由于野生亚麻种子发芽率低，人工条件育苗获得幼茎需要5个月时间，如果提取原料为多年生野生种，那么获得所需的提取材料会更加困难，提取工作也受时间的限制。因此利用种子提取DNA的方法便可以打破这种限制。由于野生亚麻种皮上的果胶质远大于茎叶，故而提取难度较茎叶大。故本专利在前人研究基础之上，着重解决利用野生亚麻种子提取总DNA，既达到高浓度、高纯度、大量提取的目的，又能克服提取时间的限制，满足分子生物学实验的需要。
技术实现思路
本专利技术目的是提供了一种野生亚麻种子总DNA提取方法。本专利技术通过以下技术方案实现：一种野生亚麻种子总DNA提取方法，包括如下步骤：步骤1、用液氮将研钵和杵预冷，取0.25g野生亚麻种子置于研钵中，迅速研磨至粉末状，之后向研钵中加入65℃的提取缓冲液10mL，在水浴锅中继续研磨至充分混匀，得到野生亚麻种子匀浆；步骤2、将步骤1制得的野生亚麻种子匀浆用尼龙网兜过滤；步骤3、将步骤2过滤后的滤液用1.5mL离心管分装，每个离心管内滤液容积为0.6mL，65℃水浴10min，水浴的同时轻轻摇动离心管，水浴后将离心管冷却至室温后，以转速10000r/min，离心10分钟，离心后取上清液待用；步骤4、将步骤3得到的上清液加入0.33体积的5mol/l的醋酸钾溶液，混匀后置于0℃冰浴保持30min，以转速10000r/min，离心10分钟，离心后取上清液待用；步骤5、将步骤4得到的上清液加入0.6倍体积的预冷异丙醇，混匀后的溶液在-20℃条件下静置2h得到的混合物，利用微提取器吸取悬浮物，使之与管底部果胶质分离，留悬浮物待用；步骤6、将步骤5得到的沉淀物用无水乙醇洗涤2次后，自然晾干后，加50μL超纯水混匀后在-20℃条件下静置8～10h，得到的溶液中加人300μL超纯水稀释，稀释后加5μLRNA酶，混匀后置于水浴锅中37℃水浴1h，得到溶液待用；步骤7、将步骤6得到的溶液加入0.6倍体积的预冷异丙醇，混匀后在-20℃条件下静置2h，得到的混合物，利用微提取器吸取悬浮物，使之与管底部果胶质分离，留悬浮物待用；步骤8、将步骤7得到的沉淀物用无水乙醇洗涤2次后，自然晾干后，加25～50μL超纯水混匀后，得到野生亚麻种子总DNA，置于-80℃保存；步骤9、将步骤8得到的野生亚麻种子总DNA利用琼脂糖检测条带完整性及纯度，分光光度计检测浓度。本专利技术所述的野生亚麻种子总DNA提取方法，步骤1中所述的提取缓冲液的配方为每1000ml缓冲液中含有100mmol醋酸钠、50mmol乙二胺四乙酸二钠、500mmol氯化钠、2％聚乙烯吡咯烷酮、1.4％十二烷基磺酸钠。本专利技术所述的野生亚麻种子总DNA提取方法，步骤2中的尼龙网兜过滤用纱布过滤代替。尼龙网兜过滤可用纱布代替，但会影响产量，如果不要求大量提取，可以用纱布替代。本专利技术所述的野生亚麻种子总DNA提取方法，步骤3中的水浴锅中放置浮漂。本专利技术所述的野生亚麻种子总DNA提取方法，步骤4中醋酸钾溶液的pH值为4.8。本专利技术所述的野生亚麻种子总DNA提取方法，步骤5中混匀后的溶液在室温下静置8～10h后得到混合物。本专利技术所述的野生亚麻种子总DNA提取方法，步骤5中的混合物在室温下以转速10000r/min，离心10分钟，得到沉淀物待用。步骤5中的混合物中没有沉淀出现，则采用离心分离的方法得到沉淀物，用来代替微提取器吸取沉淀。本专利技术所述的野生亚麻种子总DNA提取方法，步骤7中的混合物在室温下以转速10000r/min，离心10分钟，得到沉淀物待用。步骤7中的混合物中没有沉淀出现，则采用离心分离的方法得到沉淀物，用来代替微提取器吸取沉淀。本专利技术所述的野生亚麻种子总DNA提取方法，经液氮研磨之后，再用缓冲液研磨，使DNA充分溶于缓冲液中而不被破坏，有益效果是加大了DNA的产率。而经过过滤的DNA提取缓冲液在提取初期就先去掉一部分果胶质，直接降低了DNA的粘稠度。本专利技术步骤简单，实验试剂无毒，提取量大，解决了无法获得或者获取茎叶材料困难的难题，打破DNA提取在时间上限制，只要有种子且需要DNA时，随时可以提取。附图说明附图1为具体实施方式一野生亚麻种子总DNA提取的电泳检测对比图。具体实施方式具体实施方式一：一种野生亚麻种子总DNA提取方法，包括如下步骤：步骤1、用液氮将研钵和杵预冷，取0.25g野生亚麻种子置于研钵中，迅速研磨至粉末状，之后向研钵中加入65℃的提取缓冲液10mL，在水浴锅中继续研磨至充分混匀，得到野生亚麻种子匀浆；步骤2、将步骤1制得的野生亚麻种子匀浆用尼龙网兜过滤；步骤3、将步骤2过滤后的滤液用1.5mL离心管分装，每个离心管内滤液容积为0.6mL，65℃水浴10min，水浴的同时轻轻摇动离心管，水浴后将离心管冷却至室温后，以转速10000r/min，离心10分钟，离心后取上清液待用；步骤4、将步骤3得到的上清液加入0.33体积的5mol/l的醋酸钾溶液，混匀后置于0℃冰浴保持30min，以转速10000r/min，离心10分钟，离心后取上清液待用；步骤5、将步骤4得到的上清液加入0.6倍体积的预冷异丙醇，混匀后的溶液在-20℃条件下静置2h得到的混合物，利用微提取器吸取悬浮物，使之与管底部果胶质分离，留悬浮物待用；步骤6、将步骤5得到的沉淀物用无水乙醇洗涤2次后，自然晾干后，加50μL超纯水混匀后在-20℃条件下静置8h，得到的溶液中加人300μL超纯水稀释，稀释后加5μLRNA酶，混匀后置于水浴锅中37℃水浴1h，得到溶液待用；步骤7、将步骤6得到的溶液加入0.6倍体积的预冷异丙醇，混匀后在-20℃条件下静置2h，得到的混合物，利用微提取器吸取悬浮物，使之与管底部果胶质分离，留悬浮物待用；步骤8、将步骤7得到的沉淀物用无水乙醇洗涤2次后，自然晾干后，加25μL超纯水混匀后，得到野生亚麻种子总DNA，置于-80℃保存；步骤9、将步骤8得到的野生亚麻种子总DNA利用琼脂糖检测条带完整性及纯度，分光光度计检测浓度。本实施方式所述的野生亚麻种子总DNA提取方法，步骤1中所述的提取缓冲液的配方为每1000ml缓冲液中含有100mmol醋酸钠、50mmol乙二胺四乙酸二钠、500mmol氯化钠、2％聚乙烯吡咯烷酮、1.4％十二烷基磺酸钠。本实施方式所述的野生亚麻种子总DNA提取方法，步骤3中的水浴锅中放置浮漂。本实施方式所述的野生亚麻种子总DNA提取方法，步骤4中醋酸钾溶液的pH值为4.8。本实施方式所述的野生亚麻种子总DNA提取方法，附图1为本实施方式野生亚麻种子总DNA提取的电泳检测对比图，其中第1泳道为15000bp的DNAmarker，第2、3、4泳道为本方法茎叶提取，第5、6、7、8为本方法种子提取，第9、10、11、泳道为3％CTAB法。图1电泳图是DNA提取液经过稀释5倍之后上样获得的。从电泳图上可以看出种子总DNA的提取量最大，条带清晰无杂质，提取DNA长度位于maker之上，提取的DNA较完整，R本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种野生亚麻种子总DNA提取方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1、用液氮将研钵和杵预冷，取0.25g野生亚麻种子置于研钵中，迅速研磨至粉末状，之后向研钵中加入65℃的提取缓冲液10mL，在水浴锅中继续研磨至充分混匀，得到野生亚麻种子匀浆；步骤2、将步骤1制得的野生亚麻种子匀浆用尼龙网兜过滤；步骤3、将步骤2过滤后的滤液用1.5mL离心管分装，每个离心管内滤液容积为0.6mL，65℃水浴10min，水浴的同时轻轻摇动离心管，水浴后将离心管冷却至室温后，以转速10000r/min，离心10分钟，离心后取上清液待用；步骤4、将步骤3得到的上清液加入0.33体积的5mol/L的醋酸钾溶液，混匀后置于0℃冰浴保持30min，以转速10000r/min，离心10分钟，离心后取上清液待用；步骤5、将步骤4得到的上清液加入0.6倍体积的预冷异丙醇，混匀后的溶液在‑20℃条件下静置2h得到的混合物，利用微提取器吸取悬浮物，使之与管底部果胶质分离，留悬浮物待用；步骤6、将步骤5得到的沉淀物用无水乙醇洗涤2次后，自然晾干后，加50μL超纯水混匀后在‑20℃条件下静置8～10h，得到的溶液中加人300μL超纯水稀释，稀释后加5μLRNA酶，混匀后置于水浴锅中37℃水浴1h，得到溶液待用；步骤7、将步骤6得到的溶液加入0.6倍体积的预冷异丙醇，混匀后在‑20℃条件下静置2h，得到的混合物，利用微提取器吸取悬浮物，使之与管底部果胶质分离，留悬浮物待用；步骤8、将步骤7得到的沉淀物用无水乙醇洗涤2次后，自然晾干后，加25～50μL超纯水混匀后，得到野生亚麻种子总DNA，置于‑80℃保存；步骤9、将步骤8得到的野生亚麻种子总DNA利用琼脂糖检测条带完整性及纯度，分光光度计检测浓度。...

【技术特征摘要】
1.一种野生亚麻种子总DNA提取方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1、用液氮将研钵和杵预冷，取0.25g野生亚麻种子置于研钵中，迅速研磨至粉末状，之后向研钵中加入65℃的提取缓冲液10mL，在水浴锅中继续研磨至充分混匀，得到野生亚麻种子匀浆；步骤2、将步骤1制得的野生亚麻种子匀浆用尼龙网兜过滤；步骤3、将步骤2过滤后的滤液用1.5mL离心管分装，每个离心管内滤液容积为0.6mL，65℃水浴10min，水浴的同时轻轻摇动离心管，水浴后将离心管冷却至室温后，以转速10000r/min，离心10分钟，离心后取上清液待用；步骤4、将步骤3得到的上清液加入0.33体积的5mol/L的醋酸钾溶液，混匀后置于0℃冰浴保持30min，以转速10000r/min，离心10分钟，离心后取上清液待用；步骤5、将步骤4得到的上清液加入0.6倍体积的预冷异丙醇，混匀后的溶液在-20℃条件下静置2h得到的混合物，利用微提取器吸取悬浮物，使之与管底部果胶质分离，留悬浮物待用；步骤6、将步骤5得到的沉淀物用无水乙醇洗涤2次后，自然晾干后，加50μL超纯水混匀后在-20℃条件下静置8～10h，得到的溶液中加人300μL超纯水稀释，稀释后加5μLRNA酶，混匀后置于水浴锅中37℃水浴1h，得到溶液待用；步骤7、将步骤6得到的溶液加入0.6倍体积的预冷异丙醇，混匀后在-20℃条件下静置2h，得到的混合物，利用微提取器吸取悬浮物，使之与管...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋鑫玲，曹洪勋，王晓楠，赵越，孙宇峰，李秋芝，夏尊民，姜籽竹，
申请(专利权)人：黑龙江省科学院大庆分院，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23