本发明专利技术涉及基因工程领域。具体地，本发明专利技术涉及酸性耐高温纤维素酶Cel5及其基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术提供了一个新的纤维素酶基因，其编码的纤维素酶具有良好的性质，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明专利技术的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的纤维素酶。
Acid high temperature resistant cellulase Cel5 and its gene and Application
The present invention relates to the field of genetic engineering. Specifically, the invention relates to a high temperature resistant acidic cellulase Cel5 gene and application thereof, its amino acid sequence is shown as SEQ ID or SEQ NO.1 ID NO.2. The present invention provides a new cellulase gene whose encoded cellulase has good properties and can be used in feed, food, medicine and other industries. According to the technical proposal of the invention, cellulase can be produced with genetic engineering means and has good properties and is suitable for industrial application.
【技术实现步骤摘要】
酸性耐高温纤维素酶Cel5及其基因和应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及酸性耐高温纤维素酶Cel5及其基因和应用。
技术介绍
纤维素酶是指能够水解葡萄糖苷键，将纤维素分解成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称。其对纤维素的水解过程主要包括三步：第一步是内切型纤维素酶作用于纤维素内部的无定形区，随即水解β－(1→4)糖苷键将纤维素分子截短，随后外切型纤维素酶，作用于纤维素线状分子末端，水解β－(1→4)糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，最后，葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。纤维素酶已被广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值。纤维素酶的最主要来源是微生物，用其生产是最为有效和方便的。不同微生物合成的纤维素酶在组成上差异明显。对纤维素的降解能力也不尽相同。细菌与放线菌生产的纤维素酶产量均不高，在工业上很少应用。而真菌具有产酶的诸多优点：产酶能力强，产生的纤维素酶为胞外酶，便于酶的分离和提取，且产生纤维素酶的酶系结构较为合理；酶之间有强烈的协同作用，降解纤维素的效率高。纤维素酶按作用的最适pH不同可分为：酸性纤维素酶，最适pH约为4.8；中性纤维素酶，最适pH6-8；碱性纤维素酶，最适pH8-11。目前国内外，虽然许多纤维素酶被克隆分离及性质测定，但这些酶的性质特征，均存在一些缺陷，例如，pH作用范围不合适，热稳定性差，表达量低等，均不能满足实际应用的需要。因此人们希望能够找到新的能够满足实际应用需求的纤维素酶，从而能够进一步推广纤维素酶在饲料、食品、医药等行业中应用。专利
技术实现思路
本专利技术从TalaromycesleycettanusJCM12802菌株中得到了一个新的纤维素酶基因，其编码的纤维素酶具有以下几个优点：酸性、耐高温、容易发酵生产。所有这些优点都意味着新专利技术的纤维素酶在饲料、食品、医药等行业中，将会比一千报道的纤维素酶更有应用价值。本专利技术的目的是提供一种酸性、耐高温的纤维素酶。本专利技术的再一目的是提供上述纤维素酶的基因。本专利技术的再一目的是提供包含上述纤维素酶的重组载体。本专利技术的再一目的是提供包含上述纤维素酶基因的重组菌株。本专利技术的再一目的是提供一种制备纤维素酶的方法。本专利技术的再一目的是提供上述纤维素酶的应用。本专利技术首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的新的纤维素酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1：其中，该酶全长409个氨基酸，N端18个氨基酸为信号肽序列“MFFSKLAVSIAALASSATA”。因此，成熟的纤维素酶Cel5的理论分子量为42.5kDa，其氨基酸序列如SEQIDNO.2：该纤维素酶的最适pH为3.5，在pH3.0-6.0范围内，该酶能够维持其40％以上的酶活力；最适温度为80℃，在85℃时依然具有约40％的酶活力，在70℃下处理60min，剩余酶活在70％以上，在75℃下处理10min，依然能够保持36％的酶活力，具有良好的热稳定性。本专利技术还提供了编码上述纤维素酶的基因。该酶的全基因序列如SEQIDNO.3所示：本专利技术通过PCR的方法分离克隆了这个纤维素酶基因cel5，DNA全序列分析结果表明，纤维素酶Cel5结构基因全长1464bp，含有4个内含子，+91～161bp为+374～429bp,+495～591bp,+650～753bp其内含子序列，cDNA长1230bp，其cDNA序列如SEQIDNO.4所示：其中，信号肽的碱基序列为：“ATGAAGTTTTCCAACGTGATTCTTGCGGCCAGCGCGTCGAGCCTGGTGCTCGCT”因此，成熟基因的编码序列为SEQIDNO.5所示：成熟蛋白理论分子量为42.5kDa，该酶属于糖基水解酶第5家族。将纤维素酶基因cel5cDNA序列通过比对确定Cel5是一种新的纤维素酶基因。本专利技术还提供了包含上述纤维素酶基因的重组载体，优选为pPIC9-cel5。将本专利技术的纤维素酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，优选为将纤维素酶基因插入到质粒pPIC9上的SnaBI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-cel5。本专利技术还提供了包含上述纤维素酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/cel5。本专利技术还提供了一种制备纤维素酶的方法，包括以下步骤：1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶的表达；以及3)回收并纯化所表达的纤维素酶。其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichiapastoris)细胞、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichicpastoris)GS115，得到重组菌株GS115/cel5。本专利技术还提供了上述纤维素酶的应用。运用基因工程手段来产业化生产纤维素酶。本专利技术提供了一个新的纤维素酶基因，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本专利技术的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的纤维素酶。附图说明图1本专利技术重组纤维素酶的SDS-PAGE电泳图。图2本专利技术纤维素酶的酶学性质。具体实施方式试验材料和试剂1、菌株及载体：毕赤酵母(PichiapastorisGS115)为本实验室保存；毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基：(I)产酶培养基：30g/L麦麸，30g/L玉米芯粉，30g/L豆粕，5g/L大麦葡聚糖，5g/L(NH4)SO4，1g/LKH2PO4，0.5g/LMgSO4·7H2O，0.01g/LFeSO4·7H2O，0.2g/LCaCl2于1L去离子水中，121℃，15磅条件下灭菌处理20min(2)大肠杆菌培养基LB(126蛋白胨、0.5％酵母提取物、126NaCI，pH7.O)。(3)BMGY培养基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.000049<Biotin，1％甘油(v/v)。(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1纤维素酶编码基因cel5的克隆提取TalaromycesleycettanusJCM12802基因组DNA，以Talaromycesleycettanus总DNA为模板，以cel-F和cel-R为引物进行PCR扩增(见表1)，PCR反应参数为：95℃5min；94℃30sec,60℃30sec,72℃30sec,30个循环，得到一约1400bp片段，将该片段回收后送睿博生物技术有本文档来自技高网...
【技术保护点】
酸性耐高温纤维素酶Cel5，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.酸性耐高温纤维素酶Cel5，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。2.一种纤维素酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的纤维素酶Cel5。3.根据权利要求2所述的纤维素酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。4.包含权利要求2所述纤维素酶基因的重组表达载体。5.包含权利要求2所述纤维...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚斌，罗会颖，郑菲，涂涛，苏小运，黄火清，王苑，柏映国，王亚茹，孟昆，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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