本发明专利技术涉及在阴离子交换树脂材料上纯化高纯度的二价阳离子结合蛋白的方法、用所述方法得到的二价阳离子结合蛋白和包含实施所述方法所用工具的试剂盒。
Method for purifying two valence cation binding protein in anion exchange resin
The present invention relates to the anion exchange resin material on two valence cation two valence cation binding protein purification method, obtained by the method of binding protein and a kit containing the tools for implementing the method.
【技术实现步骤摘要】
二价阳离子结合蛋白在阴离子交换树脂上的纯化方法本申请是国际申请日为2011年4月29日、国家申请号为201180032360.4（国际申请号为PCT/EP2011/056832）、专利技术名称为“二价阳离子结合蛋白在阴离子交换树脂上的纯化方法”的申请的分案申请。专利
本专利技术涉及在阴离子交换树脂材料上高纯度地纯化二价阳离子结合蛋白的方法、涉及可用所述方法得到的二价阳离子结合蛋白和涉及包含实施所述方法所用工具(means)的试剂盒。专利技术背景到目前为止，许多哺乳动物蛋白如下在宿主细胞中产生：例如，用编码所述蛋白的DNA转染细胞并使重组细胞在有利于所述蛋白表达的条件下生长。由细胞分泌到细胞培养基中或存在于细胞内的蛋白可使用色谱技术，例如离子交换色谱、亲和色谱等，与培养基和其它组分分离。为了进一步的药学应用，纯化尤为重要。然而，目的蛋白完全纯化后，必须保持蛋白的生物学活性。通过二价阳离子从阴离子交换树脂洗脱钙结合蛋白的概念在大概三十年前被首次报道。尽管从牛血浆成功分离了牛因子VII，人因子VII的纯化仍是有问题的，即，产生的物质仅为部分纯的或得到的量少使得其被表征为无可检测蛋白情况下的活性。本领域工作者通过将蛋白吸附到二价阳离子(即柠檬酸钡)然后通过阴离子交换色谱分离蛋白的方法成功从人血浆中分离了足够量的人因子VII(得率约为30%)。此外，借助常规的离子交换树脂，例如阴离子交换树脂和使用包含二价阳离子，例如钙离子(Ca2+)、钡离子(Ba2+)和锶离子(Sr2+)的洗脱液从产生具有不同比活的维生素K依赖性蛋白的细胞培养物中回收和纯化维生素K依赖性蛋白的方法是可用的。此外，用于在溶液中纯化因子IX(FIX)的方法是可用的，其包括以下步骤：将包含FIX的溶液加样到阴离子交换树脂，用电导率低于从树脂洗脱FIX所需电导率的溶液洗涤阴离子交换树脂，以及用包含二价阳离子的第一洗脱液从阴离子交换树脂洗脱FIX，以形成第一洗出液。然后将第一洗出液加样到肝素或肝素样树脂以形成第二洗出液，将第二洗出液加样到羟磷灰石以形成第三洗出液，在洗涤步骤中利用高电导率洗涤剂。因子IX(FIX)为凝血系统的维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶，属于肽酶家族S1。FIX为无活性的，除非被因子XIa或因子VIIa激活。其激活需要钙、膜磷脂和因子VIII。FIX缺乏导致隐性遗传性出血病症血友病B，其可通过给予翻译后修饰的(即磷酸化和硫酸化的)FIX成功治疗。此外，因子VII(FVII)为在凝血级联中发挥重要作用的维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶，其中其与组织因子(TF)一起启动凝血过程。当血管损伤时，TF暴露于血液和循环FVII中。一旦与TF结合，FVII被凝血酶、因子Xa、IXa、XIIa和FVIIa-TF复合物(其底物为FX和FIX)活化为FVIIa。此外，膜联蛋白V为膜联蛋白类细胞蛋白，具有以钙依赖的方式结合磷脂酰丝氨酸并形成膜结合二维晶格的能力。其可在凝血、凋亡、吞噬作用和质膜衍生微粒形成中发挥作用。因此，本专利技术的根本问题为提供高纯度地纯化二价阳离子结合蛋白的改良方法。上述技术问题在权利要求书描述的实施方案中得到解决。专利技术概述本专利技术涉及纯化二价阳离子结合蛋白的方法，其包括以下步骤：(a)将不存在二价阳离子的加样缓冲液中的二价阳离子结合蛋白加样到阴离子交换树脂材料，任选用不存在二价阳离子的洗涤缓冲液洗涤已加样的阴离子交换树脂材料；和(b)用包含至少一种二价阳离子的洗脱液洗脱二价阳离子结合蛋白，以形成包含二价阳离子结合蛋白的洗出液；其中步骤(b)中的洗脱液的pH比步骤(a)中洗涤缓冲液的pH高，或在不实施洗涤步骤的情况下，比步骤(a)中加样缓冲液的pH高。此外，本专利技术涉及可用上述方法得到的纯化的二价阳离子结合蛋白，和包含实施上述方法所用工具的试剂盒。专利技术详述在一方面，本专利技术涉及纯化二价阳离子结合蛋白的方法，其包括以下步骤：(a)将不存在二价阳离子的加样缓冲液中的二价阳离子结合蛋白加样到阴离子交换树脂材料，任选用不存在二价阳离子的洗涤缓冲液洗涤已加样的阴离子交换树脂材料；和(b)用包含至少一种二价阳离子的洗脱液洗脱二价阳离子结合蛋白，以形成包含二价阳离子结合蛋白的洗出液；其中步骤(b)中的洗脱液的pH比步骤(a)中洗涤缓冲液的pH高，或在不实施洗涤步骤的情况下，比步骤(a)中加样缓冲液的pH高。本文使用的术语“不存在二价阳离子”是指缓冲液中不存在游离二价阳离子和任何蛋白结合的二价阳离子，其中可存在与螯合剂或通过螯合剂例如EDTA络合的二价阳离子。将不存在二价阳离子的加样缓冲液中的二价阳离子结合蛋白加样到阴离子交换树脂材料可通过任何本领域已知的方法实施。特别地，适合将二价阳离子结合蛋白加样到阴离子交换树脂材料的条件是本领域技术人员所熟知的。加样缓冲液电导率的特定条件使得产物的结合依赖于蛋白质和使用的阴离子交换树脂材料的特定性质(例如配体密度和配体呈递等)。二价阳离子结合到通常高度酸性区域的(即带负电的)蛋白。二价阳离子结合时负电荷被掩盖。然而，通过将不存在二价阳离子的二价阳离子结合蛋白加样到阴离子交换材料，例如，通过螯合剂(例如EDTA)脱去结合的二价阳离子，蛋白表面携带高度负电荷的块(patches)，使其与阴离子交换配体强结合。将蛋白加样到阴离子交换树脂材料的条件常常进一步需要pH和反荷离子(例如Cl-)浓度的平衡。反荷离子的化学还影响洗脱行为，例如Cl-携带一个负电荷，中性pH时磷酸盐携带两个负电荷。与Cl-相比后者可具有更高的洗脱能力，即使当导电率较低时也如此。本专利技术使用的溶液和缓冲液的盐浓度通常在20-200mM，优选100-150mM范围内。此外，用于本专利技术方法步骤(a)中将二价阳离子结合蛋白加样到阴离子交换材料，提供二价阳离子结合蛋白与阴离子交换材料结合的条件的合适的加样缓冲液是本领域所熟知的。例如，加样缓冲液可具有<pH7.4，优选<pH7.0，更优选<pH6.5，最优选<pH6.0的pH。其可包含适合二价阳离子结合蛋白与阴离子交换树脂材料结合的任何盐浓度，可由本领域技术人员容易地确定。在一个优选的实施方案中，加样缓冲液可包含螯合剂，例如EDTA，优选2mMEDTA。本专利技术方法中可加样到阴离子交换树脂材料的包含二价阳离子结合蛋白的加样缓冲液可包含例如20mMTris、150mMNaCl和2mMEDTA。本专利技术方法任选包括用不存在二价阳离子的洗涤缓冲液洗涤已加样的阴离子交换树脂材料的步骤。该洗涤步骤可通过任何本领域已知的方法实施。用于从阴离子交换材料洗去杂质而基本上不洗脱二价阳离子结合蛋白的合适的洗涤缓冲液是本领域所熟知的。例如，洗涤缓冲液可具有<pH7.4，优选<pH7.0，更优选<pH6.5，最优选<pH6.0的pH。其可包含适合洗涤阴离子交换树脂材料而不洗脱显著量的二价阳离子结合蛋白的任何盐浓度，可由本领域技术人员容易地确定。例如，洗涤缓冲液可包含合适的缓冲剂，例如Tris或MES，优选20mMTris或20mMMES。此外，其可包含螯合剂，例如EDTA，优选2mMEDTA。此外，其可包含用于调节洗涤缓冲液电导率的合适的盐，例如NaCl，其可以如下浓度存在：<200mM，优选1本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于纯化二价阳离子结合蛋白的方法，其包括以下步骤：(a) 将不存在二价阳离子的加样缓冲液中的维生素K依赖性蛋白加样到阴离子交换树脂材料，并用不存在二价阳离子并且具有20‑200 mM盐浓度的洗涤缓冲液洗涤已加样的阴离子交换树脂材料，所述不存在二价阳离子是指缓冲液中不存在游离二价阳离子和任何蛋白结合的二价阳离子；和(b) 用包含至少一种二价阳离子的洗脱液洗脱维生素K依赖性蛋白，以形成包含维生素K依赖性蛋白的洗出液；其中步骤(b)中洗脱液的pH比步骤(a)中洗涤缓冲液的pH高至少1.5个pH单位，和其中维生素K依赖性蛋白是因子IX。
【技术特征摘要】
2010.04.29 US 61/3294871.用于纯化二价阳离子结合蛋白的方法，其包括以下步骤：(a)将不存在二价阳离子的加样缓冲液中的维生素K依赖性蛋白加样到阴离子交换树脂材料，并用不存在二价阳离子并且具有20-200mM盐浓度的洗涤缓冲液洗涤已加样的阴离子交换树脂材料，所述不存在二价阳离子是指缓冲液中不存在游离二价阳离子和任何蛋白结合的二价阳离子；和(b)用包含至少一种二价阳离子的洗脱液洗脱维生素K依赖性蛋白，以形成包含维生素K依赖性蛋白的洗出液；其中步骤(b)中洗脱液的pH比步骤(a)中洗涤缓冲液的pH高至少1.5个pH单位，和其中维生素K依赖性蛋白是因子IX。2.权利要求1的方法，其中步骤(a)中洗涤缓冲液的电导率等于或小于步骤(b)中洗脱液的电导率。3.权利要求1的方法，其中洗涤缓冲液具有100-150mM盐浓度，或步骤(b)中洗脱液的pH比步骤(a)中洗涤缓冲液的pH高至少2.0个pH单位。...
【专利技术属性】
技术研发人员：A米特雷尔，M哈斯拉切尔，C菲德勒，
申请(专利权)人：百深公司，百深有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US
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