草木樨属18个物种植物条形码的目标条形码基因及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种鉴定草木樨属18个物种植物DNA条形码技术及其应用方法。挑选整合ITS、psbA‑trnH、rbcL、matK、trnL这5个基因作为鉴定草木樨18个种的目标DNA条形码基因。基于ContigExpress的数据组织、编辑和分析法及ClustalW的多序列比对法，基于最小进化原理的Neighbor‑Joining算法和no of difference方法构建聚类图，形成一种鉴定草木樨属18个物种植物DNA条形码技术的基本用法，确立标准分类条形码基因及对应序列。该技术建立了一种快捷、高效、准确率高的草木樨属不同物种DNA条形码鉴定方法，对草木樨属各物种的区分及种质资源的利用具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
草木樨属18个物种植物条形码的目标条形码基因及其制备方法
本专利技术主要涉及鉴定18个草木樨属物种的DNA条形码基因及其分类标准序列。具体涉及草木樨属18个物种植物条形码的开发和应用。
技术介绍
草木樨为豆科一年或两年生的草本异花授粉植物，其在全世界共有19种(Stevenson,1969)。草木樨属在花的结构,颜色，种子，叶片以及果荚形态上差异很大(Klebesadel,1954；Moussavi,2001)，很难根据其形态特征和生活习性进行分类，并且在生产流通中的品种混杂程度较高，不利于种质资源区分及入库分类保存。目前，对于草木樨属不同物种的分类鉴定除了基本的形态研究外，没有更好的分类标准。因此，准确快速的鉴定并区分草木樨属物种对其生产实践具有重要意义。目前，运用DNA条形码技术对植物的分类鉴定已有报道，并已形成了相关规范，但该技术运用到草木樨的分类鉴定将面临一些困难，草木樨属物种为异花授粉植物，不同种之间杂交，遗传差异小，单个条形码基因很难清晰鉴别不同种，标准的条形码序列很难确定等。本专利技术采用DNA条形码技术，使用保守性好、特异性高的5个条形码基因，根据草木樨条形码基因扩增的碱基序列不同进行鉴定。该鉴定方法具有高效、快速、准确等特点，尤其是遗传差异较小的品种及一些种名混乱的地方品种，该方法具有更突出的区分能力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种草木樨属18个物种植物条形码的目标条形码基因。本专利技术的目的二是提供一种草木樨属18个物种植物条形码的目标条形码基因制备方法。本专利技术的目的三是提供草木樨属18个物种植物条形码的目标条形码基因标准分类条形码序列。以便高效、快速、准确的鉴定不同种草木樨。此方法操作简便，省时高效，可对未知草木樨样本进行快速鉴定，相比传统的通过观察草木樨花、叶片、果荚等形态鉴定法，可大大提高效率。该方法能在实验室条件下较短时间内很好的完成，具有很好的推广价值，有助于种子检验人员快速有效的区分不同草木樨种质资源，有利于储存库草木樨种子准确的分类保存。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种草木樨属18个物种植物条形码的目标条形码基因，其主要特点在于包括有：草木樨属植物物种鉴定，基于ITS基因的特异引物对，正向基因(5′-3′)：GGAAGKARAAGTCGTAACAAGG；反向基因(5′-3′)：RGTTTCTTTTCCTCCGCTTA；或草木樨属植物物种鉴定，基于psbA-trnH基因的特异引物对，正向基因(5′-3′)：GTTATGCATGAACGTAATGCTC；反向基因(5′-3′)：CGCGCATGGTGGATTCACAAATC；或草木樨属植物物种鉴定，基于rbcL基因的特异引物对，正向基因(5′-3′)；AGACCTWTTTGAAGAAGGTTCWGT；反向基因(5′-3′)：TCGGTYAGAGCRGGCATRTGCCA；或草木樨属植物物种鉴定，基于matK基因的特异引物对，正向基因(5′-3′)；CCCRTYCATCTGGAAATCTTGGTTC；反向基因(5′-3′)：GCTRTRATAATGAGAAAGATTCTGC；或草木樨属植物物种鉴定，基于trnL基因的特异引物对，正向基因(5′-3′)；CGAAATCGGTAGACGCTACG；反向基因(5′-3′)：ATTTGAACTGGTGACACGAG。所述的草木樨属18个物种植物条形码的目标条形码基因制备方法，其主要特点在于包括有以下步骤：A.通过草木樨的不同生物学特性初步鉴定18个种；B.幼苗DNA的提取；C.目标DNA条形码基因的筛选；D.目标DNA条形码基因片段的扩增与测序；E.测序结果的核查；F.序列比对、编辑、质量核查、目标DNA条形码序列建树；G.标准分类DNA条形码基因及对应序列的确认；H.标准分类DNA条形码基因及对应序列准确性验证。所述的草木樨属18个物种植物条形码的目标条形码基因制备方法，其主要特点在于所述的步骤F，包括基于ContigExpress的数据组织、编辑和分析法及ClustalW的多序列比对法，基于最小进化原理的Neighbor-Joining算法和noofdifference(无差法)方法构建聚类图。所述的草木樨属18个物种植物条形码的目标条形码基因制备方法，所述的步骤G中所述的草木樨属18个物种植物标准分类DNA条形码基因对应序列是以下序列1到序列18所示的DNA片段：序列1的名称为：M.wolgicus_A1_matK，序列为：序列2的名称为：M.tauricus_A36_matK，序列为：序列3的名称为：M.albus_A9_matK，序列为：序列4的名称为：M.officinalis_A48_matK，序列为：序列5的名称为：M.dentatus_A3_matK，序列为：序列6的名称为：M.hirsutus_A8_psbA-trnH，序列为：序列7的名称为：M.sulcatus_A20_psbA-trnH，序列为：序列8的名称为：M.speciosus_A29_psbA-trnH，序列为：序列9的名称为：M.elegans_A31_psbA-trnH，序列为：序列10的名称为：M.segetalis_A19_psbA-trnH，序列为：序列11的名称为：M.infestus_A6_rbcL，序列为：序列12的名称为：M.indicus_A4_rbcL，序列为：序列13的名称为：M.italicus_A27_rbcL，序列为：序列14的名称为：M.polonicus_A11_trnL，序列为：序列15的名称为：M.suaveolens_A33_trnL，序列为：序列16的名称为：M.siculus_A14_trnL，序列为：序列17的名称为：M.spicatus_A18_ITS，序列为：序列18的名称为：M.altissimus_A2_ITS，序列为：所述的草木樨属18个物种植物DNA条形码基因matK在wolgicus、tauricus、albus、officinalis、dentatus分类中的应用。所述的草木樨属18个物种植物DNA条形码基因psbA-trnH在hirsutus、sulcatus、speciosus、elegans、segetalis分类中的应用。所述的草木樨属18个物种植物DNA条形码基因rbcL在infestus、indicus、italicus分类中的应用。所述的草木樨属18个物种植物DNA条形码基因trnL在polonicus、suaveolens、siculus分类中的应用。所述的草木樨属18个物种植物DNA条形码基因ITS在spicatus、altissimus分类中的应用。本专利技术对草木樨各物种样本DNA条形码序列进行测序，使用ITS、psbA-trnH、rbcL、matK、trnH作为草木樨物种鉴定的目标DNA条形码基因，基于ContigExpress的数据组织、编辑和分析法及ClustalW的多序列比对法，基于最小进化原理的Neighbor-Joining算法和noofdifference(无差法)方法构建聚类图，形成一种鉴定草木樨属18个物种植物DNA条形码技术的基本用法，确立标准分类条形码基因及本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种草木樨属18个植物条形码的目标条形码基因的制备方法，其特征在于包括有以下步骤：A.通过草木樨的不同生物学特性初步鉴定18个种；B.幼苗DNA的提取；C.目标 DNA 条形码基因的筛选：通过预实验筛选最终确定 ITS、psbA‑trnH、rbcL、 matK、trnL 为目标条形码基因；D.目标DNA条形码基因片段的扩增与测序；通过预实验确定 5 个目标基因的反应体系和扩增条件；总反应体系为 25 µl：2×Reaction Mix 12.25 µl, Golden DNA Polymerase 0.25 µl,正反向引物各 2.5 µl, ddH2O 5 µl,2)中 DNA 模板 2.5 µl；基于 ITS 基因的特异引物对为，正向基因(5′‑3′)：GGAAGKARAAGTCGTAACAAGG； 反向基因(5′‑3′)：RGTTTCTTTTCCTCCGCTTA；基于 psbA‑trnH 基因的特异引物对为，正向基因(5′‑3′)：GTTATGCATGAACGTAATGCTC； 反向基因(5′‑3′)：CGCGCATGGTGGATTCACAAATC； 基于 rbcL 基因的特异引物对为，正向基因(5′‑3′)；AGACCTWTTTGAAGAAGGTTCWGT； 反向基因(5′‑3′)：TCGGTYAGAGCRGGCATRTGCCA；基 于 matK 基因的特异引物对为，正向基因 (5 ′ ‑3 ′ ) ； CCCRTYCATCTGGAAATCTTGGTTC ；反向基因 (5 ′ ‑3 ′ ) ： GCTRTRATAATGAGAAAGATTCTGC；基于 trnL 基因的特异引物对为，正向基因(5′‑3′)；CGAAATCGGTAGACGCTACG； 反向基因(5′‑3′)：ATTTGAACTGGTGACACGAG；使用上述特异引物对对草木樨属18个物种植物基因片段进行扩增与测序；E.测序结果的核查；F.序列比对、编辑、质量核查、目标DNA条形码序列建树；G.标准分类DNA条形码基因及对应序列的确认；H.标准分类DNA条形码基因及对应序列准确性验证；所述的步骤F，包括基于ContigExpress的数据组织、编辑和分析法及ClustalW的多序列比对法，基于MEGA软件最小进化原理的Neighbor‑Joining算法和no of difference方法构建聚类图；所述的步骤G中所述的草木樨属18个物种植物标准分类DNA条形码基因对应序列是以下序列1到序列18所示的DNA片段：序列1的名称为：M.wolgicus_A1_matK，序列为：ttcatttatt acgattgttt ctttataatt tttgtaattg gaatagtttt attactaccaaaaaatcgat ttctactttt tcaaaaagta atccgagatt attcttgttc ctctataatttttatgtatg tgaatatgaa tctatcttcc tttttctacg taataaatcc tctcatttacgattaaaatc ttttagcgtt ttttttgaac gaattttttt ttatgcaaaa agagaacatcttgtagaagt ttttgctaag gatttttcgt atactttaac atttttcaag gatcctctcattcattatgt tagatatcaa ggaaaatgca ttctggcttc aaagaatgcg ccttttttgatgaataaatg gaaacactat tttatccatt tatggcaagg tttttttgat gtttggtctcaaccaagaac gatcaatata aaccgattat ccgaacattc atttcagctt ttaggctattttttaaatgt gcggctaaat cgttcagtgg tacggagtca aatgctgcaa aatacatttctaatcgaaat tgttagcaaa aaacttgata taatagttcc aattattcct ctaattagatccttggctaa agctaaattt tgtaatgtat taggacatcc tattagtaag ccggtctgggccgattcatc cgattttgat attattgacc gatttttgcg aatatgcaga atct序列2的名称为：M.tauricus_A36_matK，序列为：ttcatttatt acgattgttt ctttataatt tttgtaattg gaatagtttt attactaccaaaaaatcgat ttctactttt tcaaaaagta atccg...

【技术特征摘要】
1.一种草木樨属18个植物条形码的目标条形码基因的制备方法，其特征在于包括有以下步骤：A.通过草木樨的不同生物学特性初步鉴定18个种；B.幼苗DNA的提取；C.目标DNA条形码基因的筛选：通过预实验筛选最终确定ITS、psbA-trnH、rbcL、matK、trnL为目标条形码基因；D.目标DNA条形码基因片段的扩增与测序；通过预实验确定5个目标基因的反应体系和扩增条件；总反应体系为25µl：2×ReactionMix12.25µl,GoldenDNAPolymerase0.25µl,正反向引物各2.5µl,ddH2O5µl,2)中DNA模板2.5µl；基于ITS基因的特异引物对为，正向基因(5′-3′)：GGAAGKARAAGTCGTAACAAGG；反向基因(5′-3′)：RGTTTCTTTTCCTCCGCTTA；基于psbA-trnH基因的特异引物对为，正向基因(5′-3′)：GTTATGCATGAACGTAATGCTC；反向基因(5′-3′)：CGCGCATGGTGGATTCACAAATC；基于rbcL基因的特异引物对为，正向基因(5′-3′)；AGACCTWTTTGAAGAAGGTTCWGT；反向基因(5′-3′)：TCGGTYAGAGCRGGCATRTGCCA；基于matK基因的特异引物对为，正向基因(5′-3′)；CCCRTYCATCTGGAAATCTTGGTTC；反向基因(5′-3′)：GCTRTRATAATGAGAAAGATTCTGC；基于trnL基因的特异引物对为，正向基因(5′-3′)；CGAAATCGGTAGACGCTACG；反向基因(5′-3′)：ATTTGAACTGGTGACACGAG；使用上述特异引物对对草木樨属18个物种植物基因片段进行扩增与测序；E.测序结果的核查；F.序列比对、编辑、质量核查、目标DNA条形码序列建树；G.标准分类DNA条形码基因及对应序列的确认；H.标准分类DNA条形码基因及对应序列准确性验证；所述的步骤F，包括基于ContigExpress的数据组织、编辑和分析法及ClustalW的多序列比对法，基于MEGA软件最小进化原理的Neighbor-Joining算法和noofdifference方法构建聚类图；所述的步骤G中所述的草木樨属18个物种植物标准分类DNA条形码基因对应序列是以下序列1到序列18所示的DNA片段：序列1的名称为：M.wolgicus_A1_matK，序列为：ttcatttattacgattgtttctttataatttttgtaattggaatagttttattactaccaaaaaatcgatttctactttttcaaaaagtaatccgagattattcttgttcctctataatttttatgtatgtgaatatgaatctatcttcctttttctacgtaataaatcctctcatttacgattaaaatcttttagcgttttttttgaacgaatttttttttatgcaaaaagagaacatcttgtagaagtttttgctaaggatttttcgtatactttaacatttttcaaggatcctctcattcattatgttagatatcaaggaaaatgcattctggcttcaaagaatgcgccttttttgatgaataaatggaaacactattttatccatttatggcaaggtttttttgatgtttggtctcaaccaagaacgatcaatataaaccgattatccgaacattcatttcagcttttaggctattttttaaatgtgcggctaaatcgttcagtggtacggagtcaaatgctgcaaaatacatttctaatcgaaattgttagcaaaaaacttgatataatagttccaattattcctctaattagatccttggctaaagctaaattttgtaatgtattaggacatcctattagtaagccggtctgggccgattcatccgattttgatattattgaccgatttttgcgaatatgcagaatct序列2的名称为：M.tauricus_A36_matK，序列为：ttcatttattacgattgtttctttataatttttgtaattggaatagttttattactaccaaaaaatcgatttctactttttcaaaaagtaatccgagattattcttgttcctctataatttttatgtatgtgaatatgaatctatcttcctttttctacgtaataaatcctctcatttacgattaaaatcttttagcgttttttttgaacgaatttttttttatgcaaaaagagaacatcttgtagaagtttttgctaaggatttttcgtatactttaacatttttcaaggatcctctcattcattatgttagatatcaaggaaaatgcattctggcttcaaagaatgcgccttttttgatgaataaatggaaacactattttatccatttatggcaaggtttttttgatgtttggtctcaaccaagaacgatcaatataaaccaattatccgaacattcatttcagcttttaggctattttttaaatgtgcggctaaatcgttcagtggtacggagtcaaatgctgcaaaatacatttctaatcgaaattgttagcaaaaaacttgatataatagttccaattattcctctaattagatccttggctaaagctaaattttgtaatctattaggacatcctattagtaagccggtctgggccgattcatccgattttgatattattgaccgatttttgcgaatatgcagaatct序列3的名称为：M.albus_A9_matK，序列为：ttcatttattacgattgtttctttatcatttttgtaattggaatagttttattactaccaaaaaatcgatttctactttttcaaaaagtaatccgagattattcttgttcctctataatttttatgtatgtgaatatgaatctatcttcctttttctacgtaataaatcctctcatttacgattaaaatcttttagcgttttttttgaacgaatttttttttatgcaaaaagagaacatcttgtagaagtttttgctaaggatttttcgtatactttaacatttttcaaggatcctctcattcattatgttagatatcaaggaaaatgcattctggcttcaaagaatgcgccttttttgatgaataaatggaaacactattttatccatttatggcaaggtttttttgatgtttggtctcaaccaagaacgatcaatataaaccaattatccgaacattcatttcagcttttaggctattttttaaatgtgcggctaaatcgttcagtggtacggagtcaaatgctgcaaaatacatttctaatcgaaattgttagcaaaaaacttgatataatagttccaattattcctctaattagatccttggctaaagctaaattttgtaatgtattaggacatcctattagtaagccggtctgggccgattcatccgattttgatattattgaccgatttttgcgaatatgcagaatct序列4的名称为：M.officinalis_A48_matK，序列为：ttcatttattacgattgtttctttataatttttgtaattggaatagttttattactaccaaaaaatcgatttctactttttcaaaaagtaatccgagattattcttgttcctctataatttttatgtatgtgaatatgaatctatcttcctttttctacgtaataaatcctctcatttacgattaaaatcttttagcgttttttttgaacgaatttttttttatgcaaaaagagaacatcttgtaaaagtttttgctaaggatttttcgtatactttaacatttttcaaggatcctctcattcattatgttagatatcaaggaaaatgcattctggcttcaaagaatgcgccttttttgatgaataaatggaaacactattttatccatttatggcaaggtttttttgatgtttggtctcaaccaagaacgatcaatataaaccaattatccgaacattcatttcagcttttaggctattttttaaatgtgcggctaaatcgttcagtggtacggagtcaaatgctgcaaaatacatttctaatcgaaattgttagcaaaaaacttgatataatagttccaattattcctctaattagatccttggctaaagctaaattttgtaatgtattaggacatcctattagtaagccggtctgggccgattcatccgattttgatattattgaccgatttttgcgaatatgcaaaatctttc序列5的名称为：M.dentatus_A3_matK，序列为：ttcatttattacgattgtttctttataatttttgtaattggaatagttttattactaccaaaaaatcgatttctactttttcaaaaagtaatccgagattattcttgttcctctataatttttatgtatgtgaatatgaatctatcttcctttttctacgtaataaatcctctcatttacgattaaaatcttttagcgttttttttgaacgaatttttttttatgcaaaaagagaacatcttgtagaagtttttgctaaggatttttcctatactttaacatttttcaaggatcctctcattcattatgttagatatcaaggaaaatgcattctggcttcaaagaatgcgccttttttgatgaataaatggaaacactattttatccatttatggcaaggtttttttgatgtttggtctcaaccaagaacgatcaatataaaccaattatccgagcattcatttcagtttttaggctattttttaaatgtgcggctaaatcgttcagtggtacggagtcaaatgctgcaaaatacatttctaatcgaaattgttagcaaaaaacttgatataatagttccaattattcctctaattagatccttggctaaagctaaattttgtaatgtattaggacatcctattagtaagccggtctgggccgattcatccgattttgatattattgaccgatttttgcgaatatgcagaatct序列6的名称为：M.hirsutus_A8_psbA-trnH，序列为：ctgcggtcgaggctccatctataaatggataatattttggttttaaagaaggatacgagtttttgaaagtaaaggggggagtaatatcaacattgttgatattactcctttacccctttactttttgttagtatgtatacatatacagaaatgaatgttttcttattttctagtattttagaagactcgtaagaacttagaagagaagaaaataaatgataatcaaaaggtataaaaagttatgtaatttagacatagtatagggcggatgtagccaagtggatcaaggcagtggatttgtgaatccaccatgcgcga序列7的名称为：M.sulcatus_A20_psbA-trnH，序列为：ctgcggtcgaagctccatctataaatggataatattttggttttaaagaaggatacgagtttttgaaaggaaaggggggagtaatatcaacaatgttgatattacttctttacccctttcctttttgttagtatgtatacatatacagaaatgaatgttttcttattttctagtagtttagaagactcgtaagaacttagaagagaagaaaataaatgataatcaaaaggtataaaaagttatgtaatttagacatagtatagggcggatgtagccaagtggatcaaggcagtggatttgtgaatccaccatgcgcga序列8的名称为：M.speciosus_A29_psbA-trnH，序列为：ctgcggtcgagctccatctataaatggataatattttggttttaaagaaggatacgagtttttgaaaggaaaggggggagtaatatcaacaatgttgatattactcctttcctttttgttagtatgtatacatatacagaaatgaatgttttcttattttatagtattttagaagactcgtaagaacttagaagaaaataaatgataatcaaaaggtataaaaagttatgtaatttagacatagtatagggcggatgtagccaagtggatcaaggcagtggatttgtgaatccaccatgcgcga序列9的名称为：M.elegans_A31_psbA-trnH，序列为：ctgcggtcgaggctccatctataaatggataatattttggttttaaagaaggatacgagtttttgaaagtaaaggggggagtaatatcaacattgttgatattactcctttacccccttactttttgttagtatgtatacatatacagaaatgaatgttttcttattttctagtattttagaagactcgtaagaact...

【专利技术属性】
技术研发人员：张吉宇，吴凡，骆凯，张代玉，王彦荣，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62