一种用于评估肿瘤免疫治疗效果的分子检测方法及引物组合物及试剂盒技术

本发明专利技术属于分子生物学检测领域，特别是涉及一种用于评估肿瘤免疫治疗效果的分子检测方法及引物组合物及试剂盒，获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管、利用淋巴细胞分离液Ficoll‑1077进行外周血单核细胞的分离、利用流式细胞仪检测CD8+T细胞PD‑1分子的表达量、利用流式细胞仪分离CD8+T细胞、利用Trizol的方法提取CD8+T细胞的总RNA，所用试剂为RNAzol RT、RNA反转录成cDNA，并同时在cDNA 5’端添加接头；PCR1、PCR2和纯化和进行高通量测序等步骤，通过从RNA 5’端接头的上游引物到T细胞受体基因（TCR）C区的下游引物，获得TCR基因序列的全长信息。

A molecular detection method, primer composition and kit for evaluating the effectiveness of tumor immunotherapy

The invention belongs to the field of molecular biology, in particular relates to a method for molecular and primer to evaluate the therapeutic effect of tumor immune detection kit and composition, the blood samples of 10mL in EDTA, the use of anticoagulant tube lymphocytes separationliquid Ficoll 1077 peripheral blood mononuclear cells were isolated, using flow cytometry to detect CD8+T 1 cell PD molecule expression by flow cytometry, isolated CD8+T cells, using Trizol method to extract the total RNA of CD8+T cells, with RNAzol RT, RNA reagent was reverse transcribed into cDNA, and at the same time in cDNA 5 'end of PCR1, PCR2 and add joint; purification and high throughput sequencing other steps, from RNA to upstream primer T cell receptor gene 5' end connector (TCR) downstream primer C, the full-length TCR gene sequence information.

【技术实现步骤摘要】
一种用于评估肿瘤免疫治疗效果的分子检测方法及引物组合物及试剂盒
本专利技术属于分子生物学检测领域，特别是涉及一种用于评估肿瘤免疫治疗效果的分子检测方法及引物组合物及试剂盒。
技术介绍
癌症免疫治疗是继手术、放射治疗、化学治疗之后的又一种对治疗癌症有明确效果的癌症治疗方法，它是通过激活人体自身免疫系统来抵御、杀死肿瘤细胞，是未来癌症治疗发展的方向。不同患者使用不同的免疫疗法均会表现出不同的信息，这就需要对癌症免疫治疗患者进行特异性的免疫系统评估以监控癌症免疫治疗效果。如PD-1抗体是当前备受瞩目，广为关注的一类肿瘤疗法，也是肿瘤免疫疗法中的主力军。PD-1免疫疗法的作用机制是针对PD-1或PD-L1设计特定的蛋白质抗体，阻止PD-1和PD-L1的识别过程，部分恢复具有抗原特异性的细胞毒性T细胞(CD8+Tcell)功能，从而使之可以杀死肿瘤细胞。流式细胞仪(FC)做为一项被广泛应用，并能快速地对均质化的细胞样品进行多参数检测的仪器，我们可以通过FC来检测CD8+T细胞的PD1表达量。通过对比治疗前后T细胞上PD-1的表达，我们可以判断PD-1抗体药是否对患者起到了效果。T细胞基因座上大量的V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)基因片段在T细胞受体的形成中会产生各种多样性重组。这种V-D-J基因的重组赋予了每一种T细胞自己独特的T细胞受体(TCR)，从而使得每一个TCR的序列能有效的成为一个T细胞克隆的唯一生物标志物。因此对T细胞TCR基因的序列组成进行测序，可以很好的定位每一种T细胞。通过TCR测序这种分子检测方法检测到CD8+T细胞的多样性状态和克隆性。低多样性表示一个人的T细胞的免疫多样性少，这种免疫状态通常具有较高感染率和高死亡率，也反映了对各种疾病的抵御能力和被治愈能力较低，同时，其T细胞克隆性增殖也较高。相反，如果T细胞多样性越高的话，说明免疫系统越有能力抵御外来疾病，这是因为高的T细胞多态性可以防止“抗原逃逸”。并且通过对比治疗前后的T细胞多态性和克隆性，从而判断病患的免疫系统是否被免疫治疗所激活。癌症免疫治疗效果监控可为患者提供一个快速的，非侵入性的免疫系统评估。并能帮助医疗工作者和癌症病人早期预测癌症免疫治疗的效果，让病患能在对抗癌症的斗争中更有效的选择治疗手段，避免了浪费癌症病人治疗的时间和金钱。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，用于评估肿瘤免疫治疗效果的分子检测方法，通过对有活性的CD8+T细胞的PD-1分子进行检测以及高通量测序构建T细胞的TCR文库，以及构建的cDNA接头和单对引物，以及文库制备方法，通过从接头的上游引物到C区的下游引物，获得TCR的多态性和克隆性。解决以上技术问题的本专利技术中的一种用于评估肿瘤免疫治疗效果的分子检测方法，其特征在于：包括如下步骤：(一)获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管；(二)利用淋巴细胞分离液Ficoll-1077(美国Sigma公司#10771)进行外周血单核细胞(PBMC)的分离；淋巴细胞分离液的作用在于可以从全血里分离淋巴细胞，因为T细胞为我们检测对象，T细胞属于淋巴细胞的一种，分离后的细胞群所获得的RNA是除去了红细胞、血小板等细胞的RNA的。所以建库使用的总RNA内含T细胞RNA模板纯度更高。(三)利用流式细胞仪检测CD8+T细胞PD-1分子的表达量；所用的抗体为：anti-CD3、anti-CD8、anti-PD1和anti-4-1BB(美国Biolegend公司，anti-CD8FITC，#300906；anti-CD3APC，#300312；PD-1，#329906；4-1BB，#309820.)冰上操作步骤：用80μL的stainingbuffer将细胞沉淀重悬(106细胞)。同时制备对照管(5个1.5mL管)：1)在一空白管中加入95μLstainingbuffer(PBS+5％FBS美国Gibco#26140079)作为不染色的同型对照，其余的对照管中分别加入90μLstainingbuffer作为单染对照，每管中加入5μL细胞悬液。2)在单染对照管中分别加入5uL的anti-CD3、anti-CD8、anti-PD1和anti-4-1BB抗体(美国Biolegend公司，anti-CD8FITC，#300906；anti-CD3APC，#300312；PD-1，#329906；4-1BB，#309820.)。如下表1：表1样品染色：准备抗体混合液(单个样品中anti-CD3、anti-CD8、anti-PD1和anti-4-1BB各5μL)，并在样品中加入抗体混合液(20μL)并温和混匀。如下表2：表2Sample1Sample2Sample3Sample4细胞悬液(μL)80808080CD3+CD8+PD1+4-1BB(μL)20202020总体积(μL)100100100100避光冰浴25min。用200μLstainingbuffer清洗，1500rpm离心10min。弃上清，加入200μLstainingbuffer重新清洗一遍。用300μLstainingbuffer重悬细胞，转移至FACS管。放置冰上并避光，送样上机进行FACS检测CD3+CD8+4-1BB+细胞的PD-1表达量。(四)利用流式细胞仪分离CD8+T细胞；(五)利用Trizol的方法提取CD8+T细胞的总RNA，所用试剂为RNAzolRT(美国MRC公司#RN190)；Trizol的方法具体步骤如下：收获细胞，转移入1.5ml离心管中，加入1mlTrizol，混匀，室温静置5min。加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。4℃离心，12000g×10min，弃上清。加入1ml75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃离心，7500g×5min，弃上清。自然风干，加入50ul的DEPCH2O溶解，得到淋巴细胞总RNA。(六)RNA反转录成cDNA，并同时在cDNA5’端添加接头,用于后面PCR扩增时5’端引物结合；在反转录时，同时添加接头，可以最小化RNA在多步反应过程中的丢失。RNA在操作中稳定性极差，非常容易降解，少量的步骤可以最大程度上减少降解，同时也节约了可用于扩增的cDNA制备时间。接头就是cDNA5‘端的核酸接头，即下面提到的“TCR5’Oligo接头”。(七)PCR1:通过单对引物的方式扩增重组TCRcDNA；(八)PCR2和纯化：为PCR1产物(扩增后的TCR序列)添加Illumina高通量测序仪的上机接头和标签，同时为增加更多的上机基因量再次扩增；PCR反应结束后，利用磁珠进行DNA纯化。PCR产物一般都含有过量的引物、TaqDNA酶及dNTP。这些成分的存在将直接影响到后续的文库质检、测序反应等过程，纯化可以去除这些影响后续实验的副产物。同时，纯化的过程也是一个片段大小筛选的过程，本专利技术中的DNA片段是在700bp左右，可利用不同体积的磁珠与PCR产物混合，磁珠/DNA不同的体积比例可以吸附不同大小的片段，利用上述磁珠体积，可以成功去掉PCR扩增时的错误(误差)片段和引物双聚体，让我们的测序上机文库只有我们的测序目标DNA片段，使得测序结果更加准确，减少误本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于评估肿瘤免疫治疗效果的分子检测方法，其特征在于：包括如下步骤：(一)获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管；(二)利用淋巴细胞分离液Ficoll‑1077进行外周血单核细胞的分离；(三)利用流式细胞仪检测CD8

【技术特征摘要】
1.一种用于评估肿瘤免疫治疗效果的分子检测方法，其特征在于：包括如下步骤：(一)获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管；(二)利用淋巴细胞分离液Ficoll-1077进行外周血单核细胞的分离；(三)利用流式细胞仪检测CD8+T细胞PD-1分子的表达量；所用的抗体为：anti-CD3、anti-CD8、anti-PD1和anti-4-1BB；(四)利用流式细胞仪分离CD8+T细胞；(五)利用Trizol的方法提取CD8+T细胞的总RNA，所用试剂为RNAzolRT；(六)RNA反转录成cDNA，并同时在cDNA5’端添加接头；(七)PCR1：通过单对引物的方式扩增重组TCRcDNA；(八)PCR2和纯化：为PCR1产物添加Illumina高通量测序仪的上机接头和标签，同时扩增，并利用磁珠进行DNA纯化；(九)进行高通量测序：将所得的cDNA文库通过IlluminaMiSeq平台进行测序，测序模式为PE300，文库变性浓度为2nM，上机浓度为20pM，并通过生物信息学分析高通量测序结果；对比治疗前后的T细胞多态性和克隆性，来判断免疫系统的对免疫治疗的反应情况。2.根据权利要求1所述的一种用于评估肿瘤免疫治疗效果的分子检测方法，其特征在于：所述步骤(六)中，具体步骤如下：按照以下比例混合每一个RNA样本：试剂体积1X(μL)，RNA8，TCR3’Oligo(dT)引物(10μM)1，孵化于72℃3分钟，接着4℃1分钟；制备PCR反应缓冲液。所述混合PCR反应缓存液与RNA样本，按照下面反应程序开始cDNA反转录：42℃60分钟；70℃10分钟；4℃永久。3.根据权利要求2所述的一种用于评估肿瘤免疫治疗效果的分子检测方法，其特征在于：所述PCR反应缓冲液：4.根据权利要求1所述的一种用于评估肿瘤免疫治疗效果的分子检测方法，其特征在于：所述步骤(七)中，按照以下比例制备反应体系：PCR1反应程序为:95℃3分钟；95℃30秒；65℃1分钟，25循环；72℃1分钟；4℃永久。5.根据权利要求1所述的一种用于评估肿瘤免疫治疗效果的分子检测方法，其特征在于：所述步骤(八)中，按照以下比例制备反应体系：PCR2反应程序为:94℃3分钟；94℃30秒；55℃30秒，15循环；72℃20分钟，72℃1分钟，4℃永久。6.根据权利要求1所述的一种用于评估肿瘤免疫治疗效果的分子检测方法，其特征在于：所述步骤(八)中，具体纯化步骤如下：(一)添加80μLAMPureXPBeads进入PCR2反应产物，混匀；(二)在室温孵化10分钟；(三)放置磁珠-PCR2产...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙涛，刘潇，
申请(专利权)人：孙涛，
类型：发明
国别省市：四川,51