一种提高酵母细胞对乙酸耐受能力的方法技术

本发明专利技术属于发酵技术领域，公开了一种提高酵母细胞对乙酸的方法以及获得酵母菌株。本发明专利技术所述提高酵母细胞对乙酸耐受能力的方法通过基因工程技术构建包含表达GadC蛋白的重组质粒，转化酵母细胞，通过酵母菌株中的GadC蛋白的表达，以调控酵母细胞对乙酸的耐受能力，提高酵母细胞对乙酸耐受性。本发明专利技术所述酵母菌株为包含重组质粒pRS416-HXT7p-GadC-TEF1的酵母菌株或包含重组质粒pRS416-TPI1p-GadC-TEF1t的酵母菌株，尤其是酵母菌株SyBE_Sc0150028和SyBE_Sc0150028。实验结果表明本发明专利技术所述酵母菌株对乙酸的耐受性能显著增强。

Method for improving tolerance of yeast cells to acetic acid

The invention belongs to the technical field of fermentation, and discloses a method for improving yeast cell to acetic acid and a yeast strain obtained. Construction of recombinant plasmid containing GadC protein expression by gene engineering method of yeast cells on acetic acid tolerance ability of the invention, the transformed yeast cells, the expression of GadC protein in the yeast strain, the regulation of yeast cells on acetic acid tolerance, improve yeast cells on acetate tolerance. The yeast strains for yeast strains containing the recombinant plasmid pRS416-HXT7p-GadC-TEF1 and recombinant plasmid containing pRS416-TPI1p-GadC-TEF1t yeast strains, especially yeast strains SyBE_Sc0150028 and SyBE_Sc0150028. The experimental results showed that the tolerance of the yeast strain to acetic acid was markedly enhanced.

【技术实现步骤摘要】
一种提高酵母细胞对乙酸耐受能力的方法
本专利技术属于发酵
，具体涉及一种提高酵母细胞对乙酸耐受能力的方法以及获得酵母菌株，尤其是利用外源的GadC蛋白在酵母细胞中表达提高酵母细胞对乙酸耐受能力的方法以及获得酵母菌株。
技术介绍
人类社会对化石能源的依赖延伸到生活的方方面面。然而，由于化石燃料的不可再生性，石油逐渐成为困扰世界各国经济和社会发展的重大问题。为了应对日益严重的能源危机，以木质纤维素如农作物秸秆、城市固体垃圾等为原料，通过微生物发酵生产新的可替代能源-燃料乙醇成为各国研究者关注的热点。然而木质纤维素原料预处理过程中的高温高压条件会导致一系列对微生物细胞有毒的物质产生，其中乙酸作为一种主要的抑制剂被广泛关注。酿酒酵母作为生产乙醇的传统菌株，广泛应用于工业生产中。天然的酿酒酵母对预处理过程中产生的大量抑制剂具有较低的耐受能力，影响后续的发酵效率和乙醇得率。而传统的脱毒步骤增加操作成本，降低纤维素乙醇的价格竞争优势。因此提高酵母菌株对抑制剂耐受性，尤其是对乙酸的耐受能力，对推进纤维素乙醇的工业化生产具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种提高酵母细胞对乙酸耐受能力的方法以及获得酵母菌株。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种提高酵母细胞对乙酸耐受能力的方法，构建含有GadC蛋白的重组质粒，转化酵母细胞。在一些实施方案中，所述重组质粒为pRS416-HXT7p-GadC-TEF1t或pRS416-TPI1p-GadC-TEF1t。其中，所述GadC蛋白具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。本专利技术提高酵母细胞对乙酸耐受能力的方法中所述转化酵母细胞为酿酒酵母宿主菌。在一些实施方案中，酿酒酵母宿主菌为酿酒酵母宿主菌BY4742。本专利技术还提供了耐受乙酸的酵母菌株，包含重组质粒pRS416-HXT7p-GadC-TEF1的酵母菌株或包含重组质粒pRS416-TPI1p-GadC-TEF1t的酵母菌株。在一些实施方案中，所述酵母菌株为酿酒酵母宿主菌BY4742。优选的，所述GadC蛋白具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。实验表明，本专利技术所述酵母菌株能明显增强对乙酸的耐受性。因此，本专利技术还提供所述酵母菌株在乙酸存在下发酵生产纤维素乙醇中的应用。本专利技术还提供一种在乙酸存在下发酵生产纤维素乙醇的方法，将本专利技术所述耐受乙酸的酵母菌株接种纤维素水解液发酵。由上述技术方案可知，本专利技术提供了提高酵母细胞对乙酸耐受能力的方法以及获得酵母菌株。本专利技术所述提高酵母细胞对乙酸耐受能力的方法通过基因工程技术构建包含表达GadC蛋白的重组质粒，转化酵母细胞，通过酵母菌株中的GadC蛋白的表达，在酵母细胞中组建GAD系统，形成新的不依赖于ATP酶的质子泵，作为酵母细胞自身质子泵的一个补充，降低乙酸环境下ATP的消耗，以调控酵母细胞对乙酸的耐受能力，从而有利于获得理想的耐受性状，提高酵母细胞对乙酸耐受性。本专利技术所述酵母菌株为包含重组质粒pRS416-HXT7p-GadC-TEF1的酵母菌株或包含重组质粒pRS416-TPI1p-GadC-TEF1t的酵母菌株，尤其是酵母菌株SyBE_Sc0150028和SyBE_Sc0150028。实验结果表明本专利技术所述酵母菌株对乙酸的耐受性能显著增强。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示实施例1所述pRS416-HXT7p-GadC-TEF1t质粒谱图；图2示实施例1乙酸对酿酒酵母SyBE_Sc0150028发酵能力的影响图；其中图(a)为菌株SyBE_Sc0150028及其对照菌株yBE_Sc0150011在乙酸条件下的生长能力；图(b)为菌株SyBE_Sc0150028及其对照菌株yBE_Sc0150011在乙酸条件下的葡萄糖消耗曲线和乙醇生产曲线；图3示实施例2所述pRS416-TPI1p-GadC-TEF1t质粒谱图；图4示实施例2乙酸对酿酒酵母SyBE_Sc0150029发酵能力的影响图；其中图(a)为菌株SyBE_Sc0150029及其对照菌株yBE_Sc0150011在乙酸条件下的生长能力；图(b)为菌株SyBE_Sc0150029及其对照菌株yBE_Sc0150011在乙酸条件下的葡萄糖消耗曲线和乙醇生产曲线。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。一种提高酵母细胞对乙酸耐受能力的方法，构建含有表达GadC蛋白的重组质粒，转化酵母细胞。研究发现，乙酸分子进入细胞后解离产生的氢离子，从而降低细胞内的pH，为了维持细胞内的中性环境，防止胞内酸化，酵母细胞激活细胞膜上ATP酶Pma1p的表达，在其作用下，将胞内多余的质子运出细胞，以维持胞内正常的pH水平。然而，该过程消耗大量的ATP，尤其是高浓度乙酸使得细胞内的ATP无法及时产生，造成胞内能量供应不足，从而损伤细胞的功能和结构。因此在存在乙酸的条件下，提高胞内的ATP供给，对解决乙酸的毒性具有重要的意义。本专利技术通过基因工程技术构建包含表达GadC蛋白的重组质粒，转化酵母细胞，通过将外源的GadC蛋白在酵母细胞中表达，在酵母细胞中组建GAD系统，形成新的不依赖于ATP酶的质子泵，作为酵母细胞自身质子泵的一个补充，降低乙酸环境下ATP的消耗，以调控酵母细胞对乙酸的耐受能力。在一些实施方案中，所述重组质粒为pRS416-HXT7p-GadC-TEF1t或pRS416-TPI1p-GadC-TEF1t。其中，所述GadC蛋白具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。本领域技术人员可以按照公知的方法构建本专利技术所述重组质粒。在一些实施方案中，本专利技术所述方法分别扩增启动子HXT7p和终止子TEF1t，酶切后依次将启动子HXT7p和终止子TEF1t连入质粒pRS416中得到质粒pRS416-HXT7p-TEF1t；然后扩增基因GadC，酶切后插入到质粒pRS416-HXT7p-TEF1t中启动子HXT7p和终止子TEF1t中间，得到质粒pRS416-HXT7p-GadC-TEF1t，质粒谱图如图1所示。在一些实施方案中，本专利技术所述方法分别扩增启动子TPI1p和终止子TEF1t，酶切后依次将启动子TPI1p和终止子TEF1t连入质粒pRS416中得到质粒pRS416-TPI1p-TEF1t；然后扩增基因GadC，酶切后插入到质粒pRS416-TPI1p-TEF1t中启动子TPI1p和终止子TEF1t中间，得到质粒pRS416-TPI1p-GadC-TEF1t，质粒谱图如图2所示。本专利技术提高酵母细胞对乙酸耐受能力的方法中所述转化酵母细胞为酿酒酵母宿主菌。在一些实施方案中，酿酒酵母宿主菌为酿酒酵母宿主菌BY4742。本专利技术也提供了耐受乙酸的酵母菌株。在一些实施方案中，所述酵母菌株为包含重组质粒pRS416-HXT7p-GadC-TEF1t的酵母菌株。在另一些实施方案中，所述酵母菌株为包本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高酵母细胞对乙酸耐受能力的方法，其特征在于，构建含有表达GadC蛋白的重组质粒，转化酵母细胞。

【技术特征摘要】
1.一种提高酵母细胞对乙酸耐受能力的方法，其特征在于，构建含有表达GadC蛋白的重组质粒，转化酵母细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组质粒为pRS416-HXT7p-GadC-TEF1t或pRS416-TPI1p-GadC-TEF1t。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述GadC蛋白具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，所述酵母细胞为酿酒酵母宿主菌BY4742。5.一种酵母菌株，其特征在于，包含重组质粒pRS...

【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，王昕，李炳志，周嗣杰，刘宝利，张伟，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12