一种提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法技术

本发明专利技术属于发酵技术领域，公开了一种提高酵母细胞对复合抑制剂的方法以及获得酵母菌株。本发明专利技术所述提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法通过基因工程技术构建包含PRO1

Method for improving tolerance of yeast cells to composite inhibitors

The invention belongs to the technical field of fermentation, and discloses a method for improving yeast cell to composite inhibitor and obtaining yeast strain. The present invention relates to a method for improving the tolerance of yeast cells to a composite inhibitor, comprising PRO1 by genetic engineering techniques

【技术实现步骤摘要】
一种提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法
本专利技术属于发酵
，具体涉及一种提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受能力的方法以及获得酵母菌株，尤其是利用脯氨酸合成途径中的关键基因PRO1提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受能力的方法以及获得酵母菌株。
技术介绍
人类社会对化石能源的依赖延伸到生活的方方面面。然而，由于化石燃料的不可再生性，石油逐渐成为困扰世界各国经济和社会发展的重大问题。为了应对日益严重的能源危机，以木质纤维素如农作物秸秆、城市固体垃圾等为原料，通过微生物发酵生产新的可替代能源-燃料乙醇成为各国研究者关注的热点。然而木质纤维素原料预处理过程中的高温高压条件会导致一系列对微生物细胞有毒的物质产生，主要包括呋喃类、弱酸类和酚类等，其中糠醛、乙酸和苯酚是三类抑制剂的典型代表。酿酒酵母作为生产乙醇的传统菌株，广泛应用于工业生产中。天然的酿酒酵母对预处理过程中产生的大量抑制剂具有较低的耐受能力，影响后续的发酵效率和乙醇得率。而传统的脱毒步骤增加操作成本，降低纤维素乙醇的价格竞争优势。因此提高酵母菌株对抑制剂耐受性，尤其是对三种代表复合抑制剂的耐受能力，对推进纤维素乙醇的工业化生产具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受能力的方法以及获得酵母菌株。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法，构建含有表达PRO1D154N,G220C突变体的重组质粒，转化酵母细胞。。在一些实施方案中，所述重组质粒为pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t。其中，所述PRO1D154N,G220C具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。本专利技术提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法中所述转化酵母细胞为酿酒酵母宿主菌。在一些实施方案中，酿酒酵母宿主菌为酿酒酵母宿主菌BY4742。本专利技术还提供了耐受复合抑制剂的酵母菌株，包含重组质粒pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t的酵母菌株。在一些实施方案中，所述酵母菌株为酿酒酵母宿主菌BY4742。优选的，所述PRO1D154N,G220C具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。实验表明，本专利技术所述酵母菌株能明显增强对复合抑制剂的耐受性。因此，本专利技术还提供所述酵母菌株在复合抑制剂存在下发酵生产纤维素乙醇中的应用。本专利技术还提供一种在复合抑制剂存在下发酵生产纤维素乙醇的方法，将本专利技术所述酵母菌株接种纤维素水解液发酵。由上述技术方案可知，本专利技术提供了提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受能力的方法以及获得酵母菌株。本专利技术所述提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法通过基因工程技术构建包含PRO1D154N,G220C突变体的重组质粒，转化酵母细胞，通过酵母菌株中的PRO1基因上第154位(D154N)和第220位(G220C)的同时突变，实现对酵母细胞耐受纤维素水解抑制物能力的调控，提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受性。本专利技术所述酵母菌株为包含重组质粒pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t的酵母菌株，尤其是酵母菌株SyBE_Sc0150012。实验结果表明本专利技术所述酵母菌株对复合抑制剂耐受性能显著增强。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示实施例1所述pRS416-HXT7p-PRO1-TEF1t质粒谱图；图2示实施例1所述pRS416-HXT7p-PRO1D154N-TEF1t质粒谱图；图3示实施例1所述pRS416-HXT7p-PRO1G220C-TEF1t质粒谱图；图4示实施例1所述pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t质粒谱图；图5示实施例1所述PRO1突变体PRO1D154N,G220C的表达对酿酒酵母在含有复合抑制剂的液体培养基中生长能力的影响图；图6示实施例2所述PRO1突变体PRO1D154N,G220C的表达对酿酒酵母在含有复合抑制剂的固体培养基中生长能力的影响图，其中图中每一列分别表示加入不同种子密度的菌液点，从左到右菌液点的种子密度OD600依次为50、5、0.5、0.05、0.005。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用了如下技术方案。一种提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法，构建含有表达PRO1D154N,G220C突变体的重组质粒，转化酵母细胞。本专利技术通过基因工程技术构建包含表达PRO1D154N,G220C突变体的重组质粒，转化酵母细胞，通过酵母菌株中的PRO1基因上第154位(D154N)和第220位(G220C)的同时突变，实现对酵母细胞耐受纤维素水解抑制物能力的调控，提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受性。在一些实施方案中，所述重组质粒为pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t。其中，所述PRO1D154N,G220C具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。本领域技术人员可以按照公知的方法构建本专利技术所述重组质粒。在一些实施方案中，本专利技术所述方法分别扩增启动子HXT7p和终止子TEF1t，酶切后依次将启动子HXT7p和终止子TEF1t连入质粒pRS416中得到质粒pRS416-HXT7p-TEF1t；然后扩增PRO1D154N,G220C，酶切后插入到质粒pRS416-HXT7p-TEF1t中启动子HXT7p和终止子TEF1t中间，得到质粒pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t，质粒谱图如图1所示。所述PRO1D154N,G220C中的突变位点为D154N、G220C。即PRO1氨基酸序列中154位D突变为N、220位G突变为C。所述PRO1D154N,G220C具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。本专利技术提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法中所述转化酵母细胞为酿酒酵母宿主菌。在一些实施方案中，酿酒酵母宿主菌为酿酒酵母宿主菌BY4742。本专利技术也提供了耐受复合抑制剂的酵母菌株。在一些实施方案中，所述酵母菌株为包含重组质粒pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t的酵母菌株。优选的，所述酵母菌株为酿酒酵母宿主菌BY4742。在一些具体实施例中，所述耐受复合抑制剂的酵母菌株为包含重组质粒pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t的酿酒酵母宿主菌BY4742，命名为SyBE_Sc0150012。实验表明，本专利技术所述酵母菌株能明显增强对复合抑制剂的耐受性。因此，本专利技术还提供所述酵母菌株在复合抑制剂存在下发酵生产纤维素乙醇中的应用。其中，所述复合抑制剂为糠醛、乙酸和苯酚。本专利技术还提供一种在复合抑制剂存在下发酵生产纤维素乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法，其特征在于，构建含有表达PRO1

【技术特征摘要】
1.一种提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法，其特征在于，构建含有表达PRO1D154N,G220C突变体的重组质粒，转化酵母细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组质粒为pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PRO1D154N,G220C具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，所述酵母细胞为酿酒酵母宿主菌BY4742。5.一种酵母菌株，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，王昕，李炳志，周嗣杰，刘宝利，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12