有效抑制仔猪流行性腹泻病毒的siRNA及用途制造技术

本发明专利技术提供有效抑制仔猪流行性腹泻病毒的siRNA及用途，能够抑制PEDV复制及增殖，可以用于针对猪流行性腹泻病毒的生物制剂的研发，同时可以结合基因编辑技术来制备和培育出携带有抗病基因的转基因动物，减少猪流行性腹泻病毒给养猪业造成的经济损失。

SiRNA and use for effectively inhibiting piglet epidemic diarrhea virus

The present invention provides a siRNA and use effective suppression of piglet diarrhea virus, can inhibit PEDV replication and proliferation, can be used to develop biological agents for porcine epidemic diarrhea virus, and can be prepared and cultivated with transgenic animal with resistance gene with gene editing technology, to the pig industry caused by porcine epidemic diarrhea virus economic losses.

【技术实现步骤摘要】
有效抑制仔猪流行性腹泻病毒的siRNA及用途
本专利技术提供有效抑制仔猪流行性腹泻病毒的siRNA及用途，能够抑制PEDV复制及增殖，属于生物

技术介绍
猪流行性腹泻是由仔猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以水样腹泻、呕吐、脱水和食欲下降为主要特征。不同年龄和不同品种的猪对本病都易感，但对哺乳仔猪的危害最为严重。尽管研制出了抗PEDV的灭活疫苗和弱毒疫苗，但由于近几年PED的流行特点和发病情况发生很大的变化，给防治工作带来了许多困难，对养猪业造成巨大的经济损失。因此，建立新的抗仔猪流行性腹泻病毒方法，加快仔猪流行性腹泻抗病育种研究具有重要的现实意义。RNA干扰（RNAi）是一种由内源性或外源性双链RNA（doublestrandedRNA，dsRNA）分子引发的转录后基因沉默（posttranscriptionalgenesilencing,PTGS）现象，是生物体本身存在的对抗侵入的病毒、转座子、转基因等外源基因，抑制其循环复制从而减弱其基因毒性作用的一种保护自身的天然机制。由于其作用的特异性、高效性，已广泛应用于抗病毒等方面的的研究。本专利技术利用RNAi、SCNT和CRISPR/Cas9基因组定点编辑技术，制备基因组定点整合抗PEDV的shRNA表达元件的转基因克隆猪。项目的顺利实施，有望获得稳定表达抑制PEDV增殖的转基因克隆猪，从而提高猪对PEDV的抵抗能力，在源头上有效预防仔猪流行性腹泻病毒病的发生。
技术实现思路
本专利技术提供了能显著抑制仔猪流行性腹泻病毒复制及增殖的siRNA的序列。本专利技术所提供的能抑制仔猪流行性腹泻病毒复制及增殖的siRNA，是下述双链RNA序列之一：1）正义链为序列表中的SEQID1所示的RNA序列，反义链为序列表中SEQID2所示的RNA序列；2）正义链为序列表中的SEQID3所示的RNA序列，反义链为序列表中SEQID4所示的RNA序列；3）正义链为序列表中的SEQID5所示的RNA序列，反义链为序列表中SEQID6所示的RNA序列；将上述双链RNA序列分别命名为siRNAPE-1-1、siRNAPE-4-1、siRNAPE-4-2。编码上述能抑制仔猪流行性腹泻病毒复制及增殖的siRNA的DNA序列也属于本专利技术的保护范围内，是下述DNA序列之一：1）正义链为序列表中的SEQID7所示的DNA序列，反义链为序列表中SEQID8所示的DNA序列；2）正义链为序列表中的SEQID9所示的DNA序列，反义链为序列表中SEQID10所示的DNA序列；3）正义链为序列表中的SEQID11所示的DNA序列，反义链为序列表中SEQID12所示的DNA序列。本专利技术的积极效果在于：本专利技术所述的两种能有效抑制猪流行性腹泻病毒复制和增殖的siRNA，其可以用于针对猪流行性腹泻病毒的生物制剂的研发，同时可以结合基因编辑技术来制备和培育出携带有抗病基因的转基因动物，减少猪流行性腹泻病毒给养猪业造成的经济损失。附图说明图1为本专利技术评估各siRNA抗仔猪流行性腹泻病毒的能力的IFA荧光显微镜成像图；图2为本专利技术评估各siRNA抗仔猪流行性腹泻病毒的能力的Hoechest33342细胞核染色图；图3为本专利技术进一步评估各siRNA抗仔猪流行性腹泻病毒的能力的RT-PCR电泳图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术进行详细地解释说明。实施例1siRNA序列的设计及抗仔猪流行性腹泻病毒能力的验证通过NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）查询PEDV的RNA信息，根据siRNA设计原则，设计了针对PEDV的siRNA序列，同时设计了一条无关的对照序列（control）。上述设计完成的siRNA序列送予苏州吉玛有限公司合成。9条siRNA分别靶向PEDV的RNA基因组的9个不同区域，长为22个碱基。其中，本专利技术所涉及的siRNA-PE-1-1的RNA序列为：5-AUUAACAACAAAAUCACAUGGA-3；siRNA-PE-4-1的RNA序列为：5-UAUUAAAACUAAAACCUUCUGG-3；siRNA-PE-4-2的RNA序列为：5-UAUUAAACCUCAGAGCCUCUGG-3；针对上述3种siRNA的作用位点的序列设计成相应的siRNA正义链及反义链序列及Control-siRNA的RNA序列：siRNA-PE-1-1正义链序列：5-CCCAUGUGAUUUUGUUGUUAAU-3（SEQIDNO.1）；siRNA-PE-1-1反义链序列：5-AUUAACAACAAAAUCACAUGGA-3（SEQIDNO.2）；siRNA-PE-4-1正义链序列：5-ACAGAAGGUUUUAGUUUUAAUA-3（SEQIDNO.3）；siRNA-PE-4-1反义链序列：5-UAUUAAAACUAAAACCUUCUGG-3（SEQIDNO.4）；siRNA-PE-4-2正义链序列：5-ACAGAGGCUCUGAGGUUUAAUA-3SEQIDNO.5）；siRNA-PE-4-2反义链序列：5-UAUUAAACCUCAGAGCCUCUGG-3（SEQIDNO.6）；Control-siRNA正义链序列:5-UAGCUAUACUCACCUUAUCAUA-3；Control-siRNA反义链序列:5-UAUGAUAAGGUGAGUAUAGCUA-3；其中，本专利技术所涉及的siRNA-PE-1-1的DNA序列为：5-ATTAACAACAAAATCACATGGA-3；siRNA-PE-4-1的DNA序列为：5-TATTAAAACTAAAACCTTCTGG-3；siRNA-PE-4-2的DNA序列为：5-TATTAAACCTCAGAGCCTCTGG-3；针对上述3种siRNA的作用位点的序列设计成相应的siRNA正义链及反义链及Control-siRNA的DNA序列为：siRNA-PE-1-1正义链序列：5-CCCATGTGATTTTGTTGTTAAT-3（SEQIDNO.7）；siRNA-PE-1-1反义链序列：5-ATTAACAACAAAATCACATGGA-3（SEQIDNO.8）；siRNA-PE-4-1正义链序列：5-ACAGAAGGTTTTAGTTTTAATA-3（SEQIDNO.9）；siRNA-PE-4-1反义链序列：5-TATTAAAACTAAAACCTTCTGG-3（SEQIDNO.10）；siRNA-PE-4-1正义链序列：5-ACAGAGGCTCTGAGGTTTAATA-3SEQIDNO.11）；siRNA-PE-4-1反义链序列：5-TATTAAACCTCAGAGCCTCTGG-3（SEQIDNO.12）；Control-siRNA正义链序列:5-TAGCTATACTCACCTTATCATA-3；Control-siRNA反义链序列:5-TATGATAAGGTGAGTATAGCTA-3。实施例2将这些退火后的ds-oligo以无DNA酶，无RNA酶水溶解成浓度为100uM的工作液，添加到电穿孔的转染体系中，混匀后，以电穿孔的方式将这些ds-oligo引入到PK-15细胞系中，37℃,培养6小时后，接本文档来自技高网...

【技术保护点】
能有效抑制PEDV复制与感染的siRNA，是下述双链RNA序列之一：正义链为序列表中的SEQ ID 1，反义链为序列表中 SEQ ID 2的双链RNA序列；正义链为序列表中的SEQ ID 3，反义链为序列表中 SEQ ID 4的双链RNA序列；正义链为序列表中的SEQ ID 5，反义链为序列表中 SEQ ID 6的双链RNA序列。

【技术特征摘要】
1.能有效抑制PEDV复制与感染的siRNA，是下述双链RNA序列之一：正义链为序列表中的SEQID1，反义链为序列表中SEQID2的双链RNA序列；正义链为序列表中的SEQID3，反义链为序列表中SEQID4的双链RNA序列；正义链为序列表中的SEQID5，反义链为序列表中SEQID6的双链RNA序列。2.权利要求1所述的能有效抑制PEDV复制及增殖的siRNA的编码序列，其特征在于所述能抑制PEDV复制与感染的siRNA的编码序列是下述双链DNA序列之一：正义链为序列表中的SEQID7所示的DNA序列，反义链为序列表中SEQID8所示的DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳红生，逄大欣，谢子聪，焦虎平，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22