一种牛凝血酶的制备方法和牛凝血酶技术

本发明专利技术公开了一种牛凝血酶的制备方法和牛凝血酶，涉及蛋白质提取技术领域。本发明专利技术公开的牛凝血酶的制备方法包括：往含有柠檬酸钠的抗凝牛血浆中加入浓度为0.8‑1.1mol/L的BaCl

The method and preparation of bovine thrombin bovine thrombin

The invention discloses a preparation method of bovine thrombin and bovine thrombin, relates to the technical field of protein extraction. Including the invention discloses a preparation method of bovine thrombin: anticoagulant to bovine plasma containing sodium citrate is added in a concentration of 0.8 1.1mol/L BaCl

【技术实现步骤摘要】
一种牛凝血酶的制备方法和牛凝血酶
本专利技术涉及蛋白质提取
，具体而言，涉及一种牛凝血酶的制备方法和牛凝血酶。
技术介绍
凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，也是血液凝血级联反应中的主要效应蛋白酶，显现出促凝和抗凝的特性。凝血酶是由在凝血酶原复合物中的非活性凝血酶原在Xa因子(FXa)因子的作用下通过蛋白裂解的方式产生。当循环凝血因子在暴露的血管外组织与组织因子相接触时，凝血酶会在组织上聚集。凝血酶通过激活血小板，催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，促进血块稳定而在血栓性疾病的引发和传播上有着核心作用。目前，国内外主要以动物血浆例如牛血浆为原料制备凝血酶(牛凝血酶)，也有报道从鲑鱼和鸵鸟血浆中制备凝血酶。其提取的方法主要有等电点沉淀法和氢氧化镁沉淀法。但现有的方法所提取的凝血酶对工艺设备条件要求高、并存在凝血酶的收率低、活性低等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种牛凝血酶的制备方法，该方法以牛血浆为原料，采用柠檬酸钡吸附法提取出牛凝血酶，其具有较高的收率，所提取的牛凝血酶比活高。本专利技术的另一目的在于提供一种牛凝血酶，由上述的制备方法所制得，该牛凝血酶具有纯度和比活高的特性。本专利技术是这样实现的：一种牛凝血酶的制备方法，其包括：往含有柠檬酸钠的抗凝牛血浆中加入BaCl2溶液，离心、收集沉淀；其中，BaCl2溶液浓度为0.8-1.1mol/L，BaCl2溶液与所述抗凝牛血浆的体积比为(5-7)：50。一种牛凝血酶，其根据上述牛凝血酶的制备方法所制得。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术的提供的牛凝血酶的制备方法，该制备方法以含有柠檬酸钠的抗凝牛血浆为原料，加入BaCl2溶液沉淀后，通过采用柠檬酸钡吸附法，把依赖于维生素K的凝血因子沉淀下来，同时除去了与牛凝血酶作用的底物，降低牛凝血酶总活性的损失，提高了牛凝血酶的比活；采用本专利技术制备方法所制备的牛凝血酶的比活为6.34U/mg，提取率为65.15％，采用本专利技术提供的制备方法可以大规模制备高活力及高收率的牛凝血酶。设备要求简单、适合大规模生产。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术实施例1提供的牛凝血酶溶液的SDS-PAGE分析结果图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术实施例的一种牛凝血酶的制备方法和牛凝血酶进行具体说明。一方面，本专利技术提供的一种牛凝血酶的制备方法，其包括如下步骤：S1血液分离取新鲜牛血液，加入柠檬酸钠抗凝，利用血球分离机进行分离，去除血细胞，取牛血桨。其中，柠檬酸钠在牛血液中的终浓度优选为3.7-3.9％，优选为3.8％(m:v)。S2沉淀往含有柠檬酸钠的抗凝牛血浆中加入BaCl2溶液，离心、收集沉淀；其中，BaCl2溶液浓度为0.8-1.1mol/L，BaCl2溶液与上述抗凝牛血浆的体积比为(5-7)：50。优选地，BaCl2溶液浓度为1mol/L，BaCl2溶液与上述抗凝牛血浆的体积比为6：50。S3溶解用EDTA溶液溶解上述沉淀，离心、取上清液。优选地，EDTA溶液浓度为0.18-0.22mol/L、pH为7.8-8.2。更优选地，EDTA溶液浓度为0.2mol/L、pH为8.0。S4透析上清液用Tris-HCl缓冲液透析，得到牛凝血酶酶原液。优选地，Tris-HCl缓冲液浓度为0.048-0.052mol/L、pH为7.1-7.3。更优选地，Tris-HCl缓冲液浓度为0.05mol/L、pH为7.2。S5激活牛凝血酶酶原液经激活处理后、得到激活后的牛凝血酶粗酶液。优选地，往上述牛凝血酶酶原液中加入终浓度为0.009-0.012mol/L的Ca2+，在26-28℃下激活1.9-2.0h。优选地，往上述牛凝血酶酶原液中加入终浓度为0.01mol/L的Ca2+，在27℃下激活1.95h。采用柠檬酸钡吸附法所得的凝血酶总活性、比活均比常规的等电点沉淀法和氢氧化镁沉淀法高。因为，血浆中大部分蛋白质是酸性蛋白，凝血酶原在等电点沉淀时其他的杂蛋白(包括部分纤维蛋白原)也一同沉淀下来，凝血酶的活性损失较大。柠檬酸钡吸附凝血酶原具有一定的选择性，只是把依赖于维生素K的凝血因子沉淀下来，同时除去了与凝血酶作用的底物，降低凝血酶总活性的损失，提高了凝血酶的比活。本专利技术提供的牛凝血酶的制备方法，可以大规模制备高活力及高收率的牛凝血酶。该制备方法对设备要求简单、适合大规模生产，制备技术达到国内先进水平，为国内凝血酶制备提供先进的技术支持。采用本专利技术所提供的制备方法提取牛血中的牛凝血酶，激活后的牛凝血酶的比活为6.34U/mg，提取率为：65.15％。进一步地，为了得到精制的牛凝血酶，上述制备方法还可包括：S6纯化将上述牛凝血酶粗酶液经浓缩处理后，用DEAE柱层析进行纯化，得到精制的牛凝血酶溶液。其中，浓缩处理为：用截留分子量为10KD的超滤离心管进行浓缩处理。DEAE柱层析进行纯化包括：洗脱步骤：经过浓缩处理后的牛凝血酶粗酶液用0-1mol/LNaCl溶液线性洗脱，控制流速为0.8-1.1ml/3min，收集洗脱液，上述洗脱液经脱盐处理后得到上述牛凝血酶溶液。优选地，控制流速为1ml/3min。优选地，A相：50mMTris-HClPH＝7.2；B相：50mMTris-HCl+1MNaclPH＝7.2；A-B相进行20CV的梯度洗脱。其中，脱盐处理包括：用0.048-0.052mol/L、pH为7.1-7.3的Tris-HCl对上述洗脱液进行脱盐换液，得到上述牛凝血酶溶液。优选地，用0.05mol/L、pH为7.2的Tris-HCl进行脱盐换液。通过上述纯化后，对牛凝血酶粗酶液进行纯化，纯化倍数16.52，回收率76.21％。经纯度鉴定，电泳条带呈单一条带，已达到电泳纯，所提取的牛凝血酶的分子量约为37kd。进一步地，为了使所得到牛凝血酶便于储存或运输，上述制备方法还可包括：S7冻干将上述牛凝血酶溶液进行冻干处理，得到牛凝血酶冻干粉。另一方面，本专利技术还提供一种牛凝血酶，其有上述牛凝血酶的制备方法所制得。另一方面，本专利技术还提供一种牛凝血酶制品，其含有上述牛凝血酶。以下结合实施例对本专利技术的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供的牛凝血酶的制备方法，其具体步骤如下。1.1血液分离取新鲜牛血液，加入柠檬酸钠抗凝，柠檬酸钠在牛血液中的终浓度为3.8％，利用血球分离机进行分离，去除血细胞，取牛血桨。1.2沉淀1.2.1往上述100ml抗凝牛血浆中加入1mol/LBaCl2溶液，BaCl2溶液的加入量为牛血浆12％，即BaCl2溶液与抗凝牛血浆的体积比为6:50。1.2.2磁力搅拌1h后，于4000r/min的转速下离心15min，收集沉淀(柠檬酸钡沉淀)。1.3溶解用0.2mol/L、pH为8.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛凝血酶的制备方法，其特征在于，其包括：往含有柠檬酸钠的抗凝牛血浆中加入BaCl

【技术特征摘要】
1.一种牛凝血酶的制备方法，其特征在于，其包括：往含有柠檬酸钠的抗凝牛血浆中加入BaCl2溶液，离心、收集沉淀；其中，BaCl2溶液浓度为0.8-1.1mol/L，BaCl2溶液与所述抗凝牛血浆的体积比为(5-7)：50。2.根据权利要求1所述牛凝血酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：用EDTA溶液溶解所述沉淀，离心、取上清液，用Tris-HCl缓冲液透析，得到牛凝血酶酶原液，经激活处理后、得到激活后的牛凝血酶粗酶液；所述牛凝血酶粗酶液经浓缩处理后，用DEAE柱层析进行纯化，得到精制的牛凝血酶溶液。3.根据权利要求2所述牛凝血酶的制备方法，其特征在于，所述EDTA溶液浓度为0.18-0.22mol/L，pH为7.8-8.2。4.根据权利要求2所述牛凝血酶的制备方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液浓度为0.048-0.052mol/L，pH为7.1-7.3。5.根据权利要求2-4中任一项所述牛凝血酶的制备方法，其特征在于，所述激活处理包括：往所述牛凝血酶酶原液中加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾芳苗，刘冬，邓飞，
申请(专利权)人：成都远睿生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51