一种猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括包被了猪流行性腹泻抗原的酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、20X浓缩洗液、酶标抗原、底物缓冲液A、底物液B、终止液。本发明专利技术以杆状病毒表达系统获得的PEDV‑S蛋白作为包被抗原，利用辣根过氧化物酶(HRP)通过过碘酸钠法对PEDV‑S蛋白进行标记，获得酶标抗原。以此作为开发的新型PED ELISA抗体检测试剂盒不但能够检测猪血清中的IgG,还能够检测初乳中的IgA,属国内外首创，具有很好特异性和灵敏性，检测时间短，能同时检测大量的样品，而且本发明专利技术试剂盒保存时间长，稳定性好。本发明专利技术对解决大批量样品猪血清中的猪流行性腹泻病毒抗体检测具有重要的现实意义。

A new antibody ELISA kit for detection of porcine epidemic diarrhea

The invention discloses a porcine epidemic diarrhea model ELISA antibody detection kit, the kit includes a package of porcine epidemic diarrhea antigen ELISA plate, negative control, positive control serum, serum 20X concentration lotion, enzyme labeled antigen, substrate A buffer substrate solution B and terminating liquid. The baculovirus expression system PEDV obtained S protein as coating antigen, horseradish peroxidase (HRP) by PEDV marker of S protein sodium periodate method to obtain enzyme labeled antigen. As a new PED ELISA antibody development kit can not only detect serum IgG, can also be detected in colostrum IgA, is the first at home and abroad, has good specificity and sensitivity, short detection time, simultaneous detection of a large number of samples, and the kit of the invention is stored for a long time, good stability. The invention has important practical significance for solving antibody detection of porcine epidemic diarrhea virus in large sample pig serum.

【技术实现步骤摘要】
一种猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒
本专利技术涉及免疫检测
，具体是涉及一种猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒.
技术介绍
猪流行性腹泻(PED)是严重危害我国养猪业的一个猪病，抗体检测是防控的关键，然而国内外尚无成熟的PEDELISA抗体检测试剂盒。目前市场上虽然有韩国安捷PEDELISA抗体检测试剂盒，但只能检测初乳中的IgA，并且这些试剂盒在国内均没有注册，因此，目前国内外尚且没有成熟的、商品化的PEDELISA抗体检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是以杆状病毒表达的PED抗原为基础，研制灵敏度高、特异性和稳定性强的ELISA抗体检测试剂盒，用于猪流行性腹泻病毒抗体的快速检测。本专利技术的技术方案是：一种猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括包被了猪流行性腹泻抗原的酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、20X浓缩洗液、酶标抗原、底物缓冲液A、底物液B、终止液。进一步地，在上述方案中，所述包被了猪流行性腹泻抗原的酶标板的制备过程中，所用的包被原是通过杆状病毒表达系统获得的PEDV-S蛋白，所用包被液是碳酸钠缓冲液，所用封闭液是含1％明胶的上述包被液。有前期研究结果表明PEDV的S蛋白可以辨别靶细胞及促使病毒和细胞膜的融合，故被认为在免疫介导中起着重要作用，而有研究表明感染PEDV的猪血清中的抗S蛋白抗体比抗N蛋白抗体更为持久，即可在更长的时间中检测到抗S蛋白的抗体，因此S蛋白是建立PEDV血清学检测方法的首选抗原。进一步地，在上述方案中，所述酶标抗原是利用辣根过氧化物酶(HRP)通过过碘酸钠法对PEDV-S蛋白进行标记。所述阴、阳性对照血清通过IFA试验鉴定获得。进一步地，在上述方案中，所述20X浓缩洗涤液配方为：氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠3g、氯化钾5g、吐温-202mL、蒸馏水20mL。进一步地，在上述方案中，所述底物缓冲液A为过氧化脲溶液，底物缓冲液A配方为每1000mL水中加入过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8gNa2HPO4·12H2O，吐温-20100μL，pH5。进一步地，在上述方案中，所述底物液B为四甲基联苯胺(TMB)溶液，底物液B的配方为每1000mL蒸馏水中加入四甲基联苯胺(TMB)700mg(40mLDMSO溶解)，10.3g柠檬酸，pH2.4。进一步地，在上述方案中，所述终止液配方：2M浓硫酸。一种猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒，其使用方法为：S1：待测血清或初乳经前处理后备用；取出试剂盒，在室温下平衡30分钟备用；20X的浓缩洗液按所需量稀释成1X备用，阴、阳性对照血清或初乳各做两个重复，加入100μL1X浓缩洗液稀释的待检血清或初乳，37℃孵育40分钟；倒出孔中的液体，用稀释好的PBST洗5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；加入按1:200稀释好的酶标抗原100μL，37℃孵育30分钟；倒出孔中的液体，用PBST洗板5次，拍干；取底物缓冲液A和底物液B等体积混匀，每孔加100μL，在暗处显色10-15分钟，每孔加入50μl的终止液终止反应，酶标仪上测定各孔在波长为450nm处的OD值；S2：结果计算，用所建立的双抗原夹心ELISA方法检测30份阴性血清或初乳，血清或初乳1:100稀释，100μL/孔，每份血清或初乳重复2孔，按照以上已确立的ELISA程序进行ELISA测定，读出D450值，计算30份血清或初乳的D450平均值和标准差；S3：根据统计学原则，D450值平均数+3×标准方差时，可以在99.9％的水准上判定为阳性，因而设定阴阳性临界值等于阴性血清或初乳的D450值平均数+3×标准方差，求得阴阳性临界值0.4，在规定的实验条件下，其D450值大于临界值，即待检血清样本D450﹥0.4，判为阳性，反之为阴性。进一步地，上述的猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒的检测原理是：酶标板上的每个孔均包被有相同量的抗原，加入待测血清后，固相包被抗原和待测血清中的抗体反应，形成固相抗原抗体复合物，洗涤除去未结合物质，再加入酶标抗原，固相免疫复合物上的抗体与酶标抗原结合，彻底洗涤未结合的酶标抗原，加入底物缓冲液A和底物液B，显色反应浅，用酶标仪检测的OD值低，表明血清中抗体水平低；反之，当待测血清中抗体含量高时，则所测的OD值高，显色反应深。根据阴、阳性对照血清的值计算待检血清抗体的阴阳性。本专利技术的有益效果是：本专利技术以杆状病毒表达系统获得的PEDV-S蛋白作为包被抗原，利用辣根过氧化物酶(HRP)通过过碘酸钠法对PEDV-S蛋白进行标记，获得酶标抗原。以此作为开发的新型PEDELISA抗体检测试剂盒不但能够检测猪血清中的IgG,还能够检测初乳中的IgA,属国内外首创，具有很好特异性和灵敏性，检测时间短，能同时检测大量的样品，而且本专利技术试剂盒保存时间长，稳定性好。本专利技术对解决大批量样品猪血清中的猪流行性腹泻病毒抗体检测具有重要的现实意义。附图说明图1是本专利技术试剂盒制备过程的流程图；图2是抗原包被ELISA板的保存期测定结果；图3是酶标抗原的保存期测定结果。具体实施方式一种猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒，包括包被了猪流行性腹泻抗原的酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、20X浓缩洗液、酶标抗原、底物缓冲液A、底物液B、终止液。包被了猪流行性腹泻抗原的酶标板的制备过程中，所用的包被原是通过杆状病毒表达系统获得的PEDV-S蛋白，所用包被液是碳酸钠缓冲液，所用封闭液是含1％明胶的上述包被液。将PEDVS蛋白克隆入杆状病毒表达载体系统中，转染昆虫细胞，获得体外表达的外源蛋白，并将该蛋白作为诊断抗原建立ELISA抗体检测方法，与原核表达的蛋白作为包被抗原相比，杆状病毒表达系统所表达的外源蛋白更加接近真实的天然蛋白的空间构象和功能，利用该系统表达的蛋白与猪血清中抗体的结合更加具有特异性和敏感性，作为理想的包被抗原蛋白。酶标抗原是利用辣根过氧化物酶(HRP)通过过碘酸钠法对PEDV-S蛋白进行标记。阴、阳性对照血清通过IFA试验鉴定获得。20X浓缩洗涤液配方为：氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠3g、氯化钾5g、吐温-202mL、蒸馏水20mL。底物缓冲液A为过氧化脲溶液，底物缓冲液A配方为每1000mL水中加入过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8gNa2HPO4·12H2O，吐温-20100μL，pH5。底物液B为四甲基联苯胺(TMB)溶液，底物液B的配方为每1000mL蒸馏水中加入四甲基联苯胺(TMB)700mg(40mLDMSO溶解)，10.3g柠檬酸，pH2.4。终止液配方：2M浓硫酸。本实施例的猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒的使用方法为：S1：待测血清或初乳经前处理后备用；取出试剂盒，在室温下平衡30分钟备用；20X的浓缩洗液按所需量稀释成1X备用，阴、阳性对照血清或初乳各做两个重复，加入100μL1X浓缩洗液稀释的待检血清或初乳，37℃孵育40分钟；倒出孔中的液体，用稀释好的PBST洗5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；加入按1:200稀释好的酶标抗原100μL，37℃孵育30分钟；倒出孔中的液体，用PBST洗板5次，拍干；取底物缓冲液A和底物液B等体积混匀，每孔加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被了猪流行性腹泻抗原的酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、20X浓缩洗液、酶标抗原、底物缓冲液A、底物液B、终止液。

【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被了猪流行性腹泻抗原的酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、20X浓缩洗液、酶标抗原、底物缓冲液A、底物液B、终止液。2.如权利要求1所述的一种猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述包被了猪流行性腹泻抗原的酶标板的制备过程中，所用的包被原是通过杆状病毒表达系统获得的PEDV-S蛋白，所用包被液是碳酸钠缓冲液，所用封闭液是含1％明胶的上述包被液。3.如权利要求1所述的一种猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗原是利用辣根过氧化物酶(HRP)通过过碘酸钠法对PEDV-S蛋白进行标记。4.如权利要求1所述的一种猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述20X浓缩洗涤液配方为：氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠3g、氯化钾5g、吐温-202mL、蒸馏水20mL。5.如权利要求1所述的一种猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述底物缓冲液A为过氧化脲溶液，底物缓冲液A配方为每1000mL水中加入过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8gNa2HPO4·12H2O，吐温-20100μL，pH5。6.如权利要求1所述的一种猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述底物液B为四甲基联苯胺(TMB)溶液，底物液B的配方为每1000mL蒸馏水中加入四甲基联苯胺(TMB)700mg(40mLDMSO溶解)，10.3g柠檬酸，pH2....

【专利技术属性】
技术研发人员：宋长绪，杨金易，曾道平，王磊，李段，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44