一种抗氧化药物筛选试剂盒制造技术

技术编号:15821190 阅读:41 留言:0更新日期:2017-07-15 03:47
本发明专利技术属于生物医药技术领域,具体涉及一种抗氧化药物筛选试剂盒及其使用方法。本发明专利技术提供的抗氧化药物筛选试剂盒包括秀丽隐杆线虫、线虫培养基、大肠杆菌OP50、2′,7′二氯氢化荧光素乙二脂,能够用于高通量筛选抗氧化药物。本发明专利技术操作简便,检测快速,适合在筛选抗氧化药物的领域大规模推广。

An antioxidant drug screening kit

The invention belongs to the technical field of biological medicine, in particular to an antioxidant drug screening kit and a method of using the same. The antioxidant drug screening kit provided by the invention comprises a Caenorhabditis elegans, a nematode culture medium, Escherichia coli OP50, 2 ', 7', two chloro fluorescein B two, and can be used for high throughput screening of antioxidant drugs. The invention has the advantages of simple operation and rapid detection, and is suitable for large-scale popularization in the field of screening antioxidant drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种抗氧化药物筛选试剂盒
本专利技术属于生物医药
,具体涉及一种抗氧化药物高通量筛选试剂盒及其使用方法。
技术介绍
近年来随着社会的快速发展,快节奏的生活环境使人们极易受到各种压力所致的氧化应激反应损伤,而过度的氧化应激损伤是导致如早衰、糖尿病以及心血管系统疾病等严重病症不可忽视的因素。因此研究毒性低、抗氧化效果显著的药物迫在眉睫。现阶段抗氧化药物筛选所常用体内动物模型主要为细胞、小鼠、大鼠。小鼠和大鼠是抗氧化药物药效检测的理想模型,但其存在试验周期长、成本高、操作繁琐以及不能高通量等问题而大大限制了其在大量抗氧化药物初筛方面的应用。细胞作为体外抗氧化模型,虽然易于在实验室进行大规模测定,节省测定时间和成本,但与体内筛选相比,其所得结果往往相关性较差。秀丽隐杆线虫培养条件简单,可以在琼脂板上或是液体培养基中取食细菌(E.coli);世代周期短,通常为3天左右;寿命短,通常为3周左右;而秀丽隐杆线虫实验群体容易放大,且可以同步化,因此秀丽隐杆线虫因为寿命周期短和容易实现高通量的优势,成为体内抗氧化药物高通量筛选的理想模型。但上述秀丽隐杆线虫体内抗氧化药物高通量筛选模型的建立需要极高的技术和经验,即使在发达国家,线虫高通量药物筛选技术目前仍停留在实验室阶段,还未进入产业化阶段,而且目前很多线虫的筛选模型还没有知识产权保护。对此,本专利技术特提供一种抗氧化药物筛选试剂盒,使用该试剂盒能够高通量筛选抗氧化药物,本专利技术同时提供上述试剂盒的使用方法。供本领域研发人员高通量准确地筛选抗氧化药物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗氧化药物筛选试剂盒,使用该试剂盒能够筛选出抗氧化药物。本专利技术的另一个目的是提供上述抗氧化药物筛选试剂盒的使用方法。本专利技术提供一种抗氧化药物筛选试剂盒,其特征在于所述试剂盒包括以下试剂:①、试剂A:秀丽隐杆线虫悬液;②、试剂B:线虫培养基;③、试剂C:大肠杆菌OP50;④、试剂D:2′,7′二氯氢化荧光素乙二脂;所述试剂盒还含有多孔板,该多孔板为黑色,带有封口膜。封口膜可减缓培养基中的水分散失。所述多孔板为384孔微孔板。所述试剂A的浓度为50条秀丽隐杆线虫/20μl,试剂C的浓度为10mg大肠杆菌/ml,试剂B的体积为25ml。所述秀丽隐杆线虫的株系为野生型N2。所述试剂A中的秀丽隐杆线虫为经同步化后,孵化至L1期的秀丽隐杆线虫,秀丽隐杆线虫同步化的步骤如下:用M9缓冲液将平板上的秀丽隐杆线虫冲下来,将冲洗液吸入离心管;4000rpm离心3min,去除上清;加入裂解液;在涡旋仪上震荡7min,使秀丽隐杆线虫的虫体破裂释放卵;4000rpm离心3min,去除上清,收集沉淀获得大量的秀丽隐杆线虫卵;M9缓冲液冲洗两次,再加入1mlM9缓冲液,置于20℃培养箱中孵化48小时,获得同步化后孵化至L1期的秀丽隐杆线虫。所述试剂C为含有大肠杆菌OP50活菌的冻干粉或菌液。冻干粉在使用时需使用培养液将其配置为浓度为10mg/ml的菌液,培养液可使用S液或M9缓冲液。所述试剂B为S液培养基。本专利技术还提供上述抗氧化药物筛选试剂盒的使用方法:(1)采用抗氧化药物筛选试剂盒筛选抗氧化药,设定空白对照组和药液测定组,将多孔板中的每一孔设置为一个独立的实验单元;(2)药液测定组,在无菌条件下将试剂B、含有待测药液的溶液、5μl试剂C以及20μl试剂A依次加入多孔板的孔中,使得每孔总体积均为50μl,设定四个平行;(3)空白对照组,在无菌条件下将试剂B、与待测药液的溶液等量的无菌水或溶媒、5μl试剂C以及20μl试剂A依次加入多孔板的孔中,使得每孔总体积均为50μl,设定四个平行;其中,所述有机溶媒的溶液为DMSO、乙醇。(4)加样完成后用封口膜将多孔板密封,并将其置20℃恒温摇床中震摇培养96小时;(5)向所有加样孔中依次加2′,7′二氯氢化荧光素乙二脂,使2′,7′二氯氢化荧光素乙二脂的终浓度为100μM,20℃恒温处理30min;(6)用荧光酶标仪在激发光504nm,发射光529nm条件下测定多孔板中各处理组的荧光,荧光值即代表活性氧水平;(7)采用统计软件对实验数据进行处理、分析,如果药液测定组的活性氧水平低于空白对照组,则证明待测药物具有抗氧化活性;如果药液测定组的活性氧水平与空白对照组无显著性差异,则证明待测药物不具有抗氧化活性;以此评价待测药物的抗氧化活性。本专利技术的有益效果:1、本专利技术提供一种基于秀丽隐杆线虫模型的抗氧化药物筛选试剂盒,该试剂盒筛选效果好,使用方法简单,可广泛用于筛选抗氧化药物及保健食品。2、此外,本试剂盒还使用了2′,7′二氯氢化荧光素乙二脂,可方便快速高通量地评估待测药物的活性氧水平,操作简单快捷,结果直观可靠。3、本专利技术为体内实验。以下提供具体实施例以实现本专利技术所述的抗氧化药物筛选试剂盒,但不限于这些实施例。附图说明图1使用抗氧化药物筛选试剂盒评估维生素C的抗氧化功效Vc1-40×10-4mM、Vc2-40×10-3mM、Vc3-40×10-2mM、Vc4-40×10-1mM、Vc5-40mM;图2使用抗氧化药物筛选试剂盒评估百草枯的促氧化功效P1-0.0625mM、P2-0.125mM、P3-0.25mM、P4-0.5mM、P5-1mM。具体实施方式实验生物:秀丽隐杆线虫野生型N2,购买于TheCaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)。细菌株:尿嘧啶渗漏突变型大肠杆菌OP50,购买于TheCaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)。试剂:S液培养基:1升S基础液,10ml1M柠檬酸钾,10mlTrace,3ml1MCaCl2,3ml1MMgSO4,1ml胆固醇(5mg/ml)。S基础液:5.85gNaCl,1gK2HPO4,6gKH2PO4,加水至1升,121℃灭菌20min备用。1M柠檬酸钾:20g柠檬酸,293.5g柠檬酸三钾,加水至1升,121℃灭菌20min。Trace缓冲液:1.86gEDTA,0.69gFeSO4.7H2O,0.2gMnCl2.4H2O,0.025gCuSO4.5H2O,0.29ZnSO4.7H2O,加水至1升,121℃灭菌20min。1MCaCl2:55.5gCaCl2溶于1升水中,121℃灭菌20min。1MMgSO4:246.47gMgSO4.7H2O溶于1升水中,121℃灭菌20min。NGM培养基:NaCl1.5g,K2HPO41.3g,KH2PO48.5g,蛋白胨1.4g,琼脂粉8.5g,蒸馏水500mL。灭菌后加入过滤除菌的500µL胆固醇(5mg/ml,无水乙醇配制),高压蒸汽灭菌的500µL1mol/LMgSO4,500µL1mol/LCaCl2。M9缓冲液:NaCl1.98g,Na2HPO42.38g,KH2PO41.20g,MgSO40.048g,蒸馏水400mL。LB液体培养基:NaCl2g,蛋白胨2g,酵母膏1g,蒸馏水200mL。溶解后用1MNaOH调节pH为7.0,高压蒸汽灭菌。裂解液:6.4%NaClO3溶液和1MNaOH溶液按体积比1:1混合。3.药材:维生素C:购自北京百灵威科技有限公司百草枯:购自北京盛世康普化工技术研究院4.仪器:高压灭菌锅(上海申安医本文档来自技高网...
一种抗氧化药物筛选试剂盒

【技术保护点】
一种抗氧化药物筛选试剂盒,其特征在于所述试剂盒含有以下试剂:①、试剂A:秀丽隐杆线虫悬液;②、试剂B:线虫培养基;③、试剂C:大肠杆菌OP50;④、试剂D:2′,7′二氯氢化荧光素乙二脂。

【技术特征摘要】
1.一种抗氧化药物筛选试剂盒,其特征在于所述试剂盒含有以下试剂:①、试剂A:秀丽隐杆线虫悬液;②、试剂B:线虫培养基;③、试剂C:大肠杆菌OP50;④、试剂D:2′,7′二氯氢化荧光素乙二脂。2.根据权利要求1所述的一种抗氧化药物筛选试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还含有多孔板,该多孔板为黑色,带有封口膜。3.根据权利要求2所述的一种抗氧化药物筛选试剂盒,其特征在于:所述多孔板为384孔微孔板。4.根据权利要求1所述的一种抗氧化药物筛选试剂盒,其特征在于,所述试剂A的浓度为50条秀丽隐杆线虫/20μl,试剂C的浓度为10mg大肠杆菌/ml,试剂B的体积为25ml。5.根据权利要求1-4任一项所述的一种抗氧化药物筛选试剂盒,其特征在于,所述秀丽隐杆线虫的株系为野生型N2。6.根据权利要求1所述的一种抗氧化药物筛选试剂盒,其特征在于,所述试剂A中的秀丽隐杆线虫为经同步化后,孵化至L1期的秀丽隐杆线虫,秀丽隐杆线虫同步化的步骤如下:用M9缓冲液将平板上的秀丽隐杆线虫冲下来,将冲洗液吸入离心管;4000rpm离心3min,去除上清;加入裂解液;在涡旋仪上震荡7min,使秀丽隐杆线虫的虫体破裂释放卵;4000rpm/离心3min,去除上清,收集沉淀获得大量的秀丽隐杆线虫卵;M9缓冲液冲洗两次,再加入1mlM9缓冲液,置于20℃培养箱中孵化48小时,获得同步化后孵化至L1期的秀丽隐杆线虫。7.根据权利要求1所述的一种抗氧化药物筛选试剂盒,其特征在于:所述试剂C为含有大肠杆菌OP50活菌的冻干粉或...

【专利技术属性】
技术研发人员:不公告发明人
申请(专利权)人:兰州红虫生物工程有限责任公司
类型:发明
国别省市:甘肃,62

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