一种Cas9核酸酶Q920P及其用途制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种Cas9核酸酶及用途。本发明专利技术的Cas9核酸酶（Cas9‑Q920P），具有Cas9核酸酶活性，适用于CRISPR/Cas9系统，所述Cas9核酸酶（Cas9‑Q920P）是将野生型Cas9核酸酶第920位谷氨酰胺突变成脯氨酸获得。采用所述Cas9核酸酶（Cas9‑Q920P）对DNA双链进行切割可产生突出断裂末端，以补平连接的方式可加入与突出断裂末端互补的碱基，能够实现对基因组DNA片段的特定位置的精准编辑。

Cas9 nuclease Q920P and uses thereof

The invention belongs to the technical field of biology, in particular to a Cas9 nuclease and an application thereof. Cas9 the nuclease (Cas9 Q920P), with Cas9 nuclease activity, suitable for the CRISPR/Cas9 system, the Cas9 nuclease (Cas9 Q920P) is a wild type Cas9 nuclease mutation to obtain 920th glutamine proline. Using the Cas9 nuclease (Cas9 Q920P) of DNA double chain cutting can produce outstanding fracture ends, with reinforcing connection can be joined with the outstanding fault end complementary base, to achieve precise position to edit specific genomic DNA fragments.

【技术实现步骤摘要】
一种Cas9核酸酶Q920P及其用途
本专利技术属于生物
，具体涉及一种Cas9核酸酶Q920P及用途。
技术介绍
自从人类基因组计划(HumanGenomeProject)和DNA元件百科全书(EncyclopediaofDNAElements)项目的完成，科学家们分析和鉴定了大量的基因组中的基因和DNA调控元件[1,2]。在基因表达调控中起重要作用的DNA调控元件包括启动子、增强子、沉默子和绝缘子等。然而，多数调控元件的功能并没有得到实验的验证和阐明[2-8]。探索基因和DNA调控元件的功能，可以通过遗传学DNA片段编辑来进行研究。早期的基因编辑和基因功能修饰是通过基因转座和转基因实现的[9-14]。伴随测序技术的发展反向遗传学被应用于对基因组进行特定的突变[15,16]。特别是依赖于同源重组的基因打靶小鼠迅速地被应用到科学研究中[15,17,18]。此外，在小鼠和斑马鱼中DNA片段的反转和重复被应用于去研究特定的基因组结构变化[19-24]。近几年，源于细菌和古菌的Ⅱ型成簇规律间隔短回文重复系统[Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associatednuclease9(Cas9)，CRISPR/Cas9]是新兴基因组编辑技术[25-27]，由于它设计简单和操作方便，迅速地被应用到真核基因组编辑。我们利用CRISPR/Cas9系统在人细胞系和小鼠中实现了DNA片段遗传编辑(删除、反转和重复)[28]。通过Cas9和两个sgRNAs在基因组中进行两个位点靶向断裂后在CtIP等蛋白参与的修复系统作用下可以实现DNA片段的删除、反转(倒位)、重复、易位和插入(如果提供供体)等[29-32]。通过对DNA片段编辑的遗传操作，能够用来研究原钙粘蛋白和珠蛋白的基因表达调控和三维基因组结构[28,31-33]。目前可以通过CRISPR/Cas9系统实现DNA片段的编辑，但是对于深入研究特定DNA区段的精准功能，有效地实现DNA片段的精准遗传编辑的Cas9核酸酶还有待发现。
技术实现思路
为了克服现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种Cas9核酸酶及用途。为了实现上述目的以及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种Cas9核酸酶(Cas9-Q920P)，具有Cas9核酸酶活性，适用于CRISPR/Cas9系统，所述Cas9核酸酶(Cas9-Q920P)是将野生型Cas9核酸酶第920位谷氨酰胺突变成脯氨酸获得。优选地，与野生型Cas9核酸酶相比，所述Cas9核酸酶(Cas9-Q920P)对目的基因组DNA片段进行切割时产生的突出断裂末端与钝断裂末端的比例不同。优选地，所述野生型Cas9核酸酶为SpCas9。进一步地，所述野生型Cas9核酸酶的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。优选地，所述Cas9核酸酶(Cas9-Q920P)含有如SEQIDNO.9所示的氨基酸序列。优选地，所述Cas9核酸酶(Cas9-Q920P)的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。本专利技术的第二方面，提供一种多核苷酸，其编码所述Cas9核酸酶(Cas9-Q920P)。本专利技术的第三方面，提供一种表达载体，其含有前述多核苷酸。本专利技术的第四方面，提供一种宿主细胞，其被前述表达载体所转化。本专利技术的第五方面，提供一种制备所述Cas9核酸酶(Cas9-Q920P)的方法，包括步骤：构建含有Cas9核酸酶(Cas9-Q920P)编码多核苷酸的表达载体，然后将所述表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述的Cas9核酸酶(Cas9-Q920P)。本专利技术的第六方面，提供前述Cas9核酸酶(Cas9-Q920P)或其编码多核苷酸或含有所述编码多核苷酸的表达载体用于基因组DNA片段编辑或用于制备基因组DNA片段编辑工具的用途。优选地，所述编辑包括单位点编辑和多位点编辑。所述多位点编辑的编辑位点数为两个及以上。优选地，所述编辑的方式包括突变、删除、反转或倒位、重复、易位或插入。本专利技术的第七方面，提供一种基因组DNA片段编辑工具，所述基因组DNA片段编辑工具为CRISPR/Cas9系统，所述CRISPR/Cas9系统包括前述Cas9核酸酶(Cas9-Q920P)或其编码多核苷酸或含有所述编码多核苷酸的表达载体。优选地，所述CRISPR/Cas9系统包括前述Cas9-Q920P和针对目的DNA片段的一个或多个sgRNA。所述多个是指两个及以上。本专利技术的第八方面，提供一种基因组DNA片段编辑方法，采用前述Cas9核酸酶(Cas9-Q920P)以及与之配合的一个或多个sgRNA，利用CRISPR/Cas9系统对待编辑的基因组DNA片段进行编辑。优选地，所述编辑包括单位点编辑和多位点编辑。所述多位点编辑的编辑位点数为两个及以上。优选地，所述编辑的方式包括突变、删除、反转或倒位、重复、易位或插入。优选地，将含有前述Cas9核酸酶(Cas9-Q920P)编码多核苷酸的表达载体以及与之配合的一个或多个sgRNA一同转入细胞中，对待编辑的基因组DNA片段进行编辑。本专利技术的第九方面，提供一种基因组DNA片段单位点编辑方法，利用CRISPR/Cas9系统，采用如权利要求1所述的Cas9核酸酶(Cas9-Q920P)对DNA双链进行切割产生突出断裂末端，通过细胞自身修复系统，以补平连接的方式加入与突出断裂末端互补的碱基。所述基因组DNA片段单位点编辑方法可以改变单位点编辑时碱基突变的特征。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术的Cas9核酸酶(Cas9-Q920P)，适用于CRISPR/Cas9系统，所述Cas9核酸酶(Cas9-Q920P)含有如SEQIDNO.9所示的氨基酸序列，所述Cas9核酸酶(Cas9-Q920P)与野生型Cas9核酸酶相比，对目的基因组DNA片段进行切割时产生的突出断裂末端及钝断裂末端的比例相对于野生型Cas9核酸酶不同。采用所述Cas9核酸酶(Cas9-Q920P)对DNA双链进行切割可产生突出断裂末端，通过细胞自身修复系统，以补平连接的方式可加入与突出断裂末端互补的碱基，能够实现对基因组DNA片段的特定位置加入特定碱基的精准编辑。附图说明图1A：Cas9在两个sgRNAs介导下对DNA双链进行切割产生四个断裂末端，这些断裂末端在细胞修复系统的作用下产生DNA片段删除、反转和重复。图1B：针对HS51位点的DNA片段删除、反转和重复情况。图1C：DNA片段删除接头处存在“G”的加入。图1D：DNA片段重复接头处存在“T”的加入。图1E：DNA片段下游反转接头处存在“A”、“G”和“AG”的加入。图1F：针对这两个特定序列的sgRNAs，Cas9切割方式比例特征。图2A：Cas9核酸酶结构示意图。图2B：β-globinRE2位点进行DNA片段编辑的两个sgRNAs的示意图。图2C：通过检测DNA片段重复接头连接情况统计出各Cas9核酸酶在sgRNA1的介导下对基因组DNA片段进行切割时所产生的各种切割末端的占比。图2D：针对上游sgRNA1，Cas9以及Cas9突变体对目的DNA片段的切割情本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Cas9核酸酶，适用于CRISPR/Cas9系统，所述Cas9核酸酶是将野生型Cas9核酸酶第920位谷氨酰胺突变成脯氨酸获得。

【技术特征摘要】
1.一种Cas9核酸酶，适用于CRISPR/Cas9系统，所述Cas9核酸酶是将野生型Cas9核酸酶第920位谷氨酰胺突变成脯氨酸获得。2.根据权利要求1所述的Cas9核酸酶，其特征在于，所述Cas9核酸酶与野生型Cas9核酸酶相比，对目的基因组DNA片段进行切割时产生的突出断裂末端与钝断裂末端的比例不同。3.根据权利要求1所述的Cas9核酸酶，其特征在于，所述野生型Cas9核酸酶为SpCas9。4.根据权利要求3所述的Cas9核酸酶，其特征在于，所述野生型Cas9核酸酶的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。5.根据权利要求1所述的Cas9核酸酶，其特征在于，所述Cas9核酸酶含有如SEQIDNO.9所示的氨基酸序列。6.一种多核苷酸，其编码如权利要求1～5任一项所述的Cas9核酸酶。7.一种表达载体，其含有如权利要求6所述的多核苷酸。8.一种宿主细胞，其被如权利要求7所述的表达载体所转化。9.一种制备如权利要求1～5任一项所述的Cas9核酸酶的方法，包括步骤：构建含有如权利要求1～5任一项所述Cas9核酸酶编码多核苷酸序列的表达载体，然后将所述表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述的Cas9核酸酶。10.如权利要求1～5任一项所述的Cas9核酸酶、或如权利要求6所述的多核苷酸或如权利要求7所述的表达载体用于基因组DNA片段编辑或用于制备基因组DNA片段编辑工具的用途。11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述编辑包括单位点编辑和多位点编辑，所述多位点编辑的编辑位点数为两个及以上。12.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述编辑的方式包括突变...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴强，李金环，寿佳，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31