三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测试剂盒与方法技术

本发明专利技术公开了一种三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测试剂盒，该试剂盒包括阴性对照、需钠弧菌（

Three crab pathogenic Vibrio natriegen double PCR rapid detection kit and method

The invention discloses a three crab pathogenic Vibrio natriegen double PCR rapid detection kit, the kit includes a negative control, Vibrio natriegen (

【技术实现步骤摘要】
三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测试剂盒与方法
本专利技术涉及一种病原菌的检测试剂盒与检测方法，特别是一种三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测试剂盒与检测方法。
技术介绍
需钠弧菌是海洋微生物中常见的兼性厌氧细菌，广泛存在于河口入海处、近海岸的海水、海底沉积物及海生动物中，是一种条件致病菌，可导致水产养殖动物患病死亡，死亡率高达87.5-100%，严重危害我国海水养殖业的健康发展。目前鉴定弧菌的技术有：1、经典的生理生化鉴定方法，该法繁琐、耗时、且要求操作人员有良好的专业素养；2、细菌快速自动鉴定系统，该法需要昂贵的仪器设备和技术熟练的操作人员；3、基于核酸的检测技术，包括DNA探针和PCR技术(聚合酶链式反应技术)，相对上述检测技术而言，该技术具有快速、简捷、灵敏等特点。但是，目前针对该需钠弧菌的研究主要停留在病原的分离和实验室鉴定，还没有一个快速检测方法报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测试剂盒，实现三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速、准确检测。本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供了应用上述试剂盒进行三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测的方法。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本专利技术是一种三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测试剂盒，其特点是，该试剂合由下列物品组成：1)阴性对照，成份为1mL灭菌双蒸水1支;2)阳性对照，试剂成份为溶于1mL灭菌双蒸水中100ng的需钠弧菌（Vibrionatriegens）XA1菌株DNA1支；3)含Mg2+、dNTP和DNA聚合酶的PCR缓冲液1支；4)引物对toxR-F/toxR-RtoxR-F为：5'-AATCCGCTTTCCTCTGTT-3'1支；toxR-R为：5'-GGCGTTAGCACAGGTACA-3'1支；5)引物对Vhh-F/Vhh-RVhh-F：5'-AATGTCATCCGCCAACGA-3'1支；Vhh-R：5'-CCGTCAGGCGAATCAATG-3'1支；6)灭菌双蒸水1支；7)包装盒子，一块泡沫板，其大小与包装盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中；将阳性对照单独存放；试剂盒于-20°C保存。本专利技术方法中所涉及的菌株需钠弧菌（Vibrionatriegens）XA1，已经在《三疣梭子蟹病原-需钠弧菌的分离和分子鉴定》中公开，上述公开文献发表于世界水产学会杂志（JOURNALOFTHEWORLDAQUACULTURESOCIETY），2016，47(6):854-861。菌株需钠弧菌（Vibrionatriegens）XA1为公知公用材料，现保存在淮海工学院海洋生命与水产学院实验室，在本专利申请日起二十年内，公众如果需要，淮海工学院海洋生命与水产学院实验室可对外发放。本专利技术所述的一种三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测试剂盒，其进一步优选的技术方案是，引物设计的设计方法如下：参照GenBank上收录需钠弧菌的溶血素vhh基因序列DQ663483和跨膜转录激活蛋白toxR基因序列JF930637设计两对引物。本专利技术还公开了一种三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测方法，其特点是，利用以上技术方案所述的试剂盒进行三疣梭子蟹需钠弧菌病原双重PCR检测方法；检测前准备细菌基因组提取试剂盒；检测步骤如下：（1）DNA模板的提取：将1mL过夜培养的需钠弧菌（Vibrionatriegens）XA1菌液，12,000g离心1min，尽量弃上清；加入100μLLB11和20μL蛋白酶K，震荡至菌体彻底悬浮；55°C孵育20min；加入20μLRNaseA混匀静置2min；加入400μLBB11涡旋30s；将全部液体加入离心柱中，12,000g离心30s，弃流出液；加入500μLCB11，12,000g离心30s，弃流出液；再加入500μLCB11，12,000g离心30s，弃流出液；加入500μLWB11，12000g离心30s，弃流出液；再加入500μLWB11，12,000g离心30s，弃流出液；12000g离心2min，彻底去除残留的WB11；将离心柱转移至一个新的1.5ml离心管中，在柱的中央加入100μL预热的洗脱液室温静置5min，12000g离心1min，洗脱DNA；再将洗脱液置于离心柱中，室温静置5min，12000g离心1min，得DNA模板，-20°C保存备用；（2）PCR预混合液的配制，分别采用以下方法：使用前将试剂盒中需用试剂离心数秒钟后，按下列方式加入各种成分，除DNA模板外的各试剂预先加入混合好后，最后加入提取的DNA模板、阳性对照或阴性对照，加DNA模板的区域与加入其它试剂的区域分开，总体积为25μL；PCR预混合液加入方式:含Mg2+、dNTP和DNA聚合酶的PCR缓冲液13μL引物对toxR-F/toxR-R各2μL引物对vhh-F/vhh-R各1μL灭菌双蒸水4-5μLDNA模板或阳性对照或阴性对照1-2μL总体积：25μL（3）将PCR预混合液装入PCR反应管，置于基因扩增仪中，如仪器无热盖，加入1-2滴石蜡油封盖；设置PCR循环参数如下，进行扩增：95℃预变性5min后，94℃变性1min、53.3℃退火45s、72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min；（4）扩增反应结束后取加入2μL溴酚蓝与3μLPCR混合液混匀，经2%琼脂糖凝胶电泳，电压按长度5V/cm电泳30-40min后于紫外分析仪下观查结果:若在308bp和526bp处出现条带，则证明需钠弧菌为阳性，说明阳性对照或待测样品中携带需钠弧菌；否则为阴性，说明阴性对照或待测样品中不携带需钠弧菌。以上所述的一种三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测方法，进一步优选的技术方案是，DNA模板的提取过程中：过夜培养的需钠弧菌（Vibrionatriegens）XA1菌液培养方法如下：取2.6g2216E固体培养基加过滤海水至100mL，调pH值为7.2-7.4，121℃灭菌20分钟后倒平板；超净台内划线接种需钠弧菌（Vibrionatriegens）XA1，28℃培养24小时后，挑取单菌落至2mL2216E液体培养基中28℃过夜培养。在虾蟹养殖过程中，通过采用本专利技术试剂盒与检测方法对养殖对象和养殖水体进行定期检测，实现海水甲壳动物需钠弧菌病原的动态监测，一经发现某一动物携带有该病原，则及时使用相应药物进行早期防治，避免病原在水产动物间的扩散传播，减少需钠弧菌病害给水生甲壳动物养殖业造成的巨大损失，从而对海水甲壳动物养殖业的健康发展起到积极有效的作用。在水产动物苗种病原检测中，本专利技术方法可以对需钠弧菌进行精准检测，确保所选亲本和放养的蟹/虾苗不携带需钠弧菌病原，减少养殖过程中需钠弧菌病害的发生。与现有技术相比，本专利技术设计了一种快速特异的双重PCR检测试剂盒与检测方法，实现对需钠弧菌精准检测。该检测方法的优点主要体现在一下几方面：1）基于溶血素（vhh）基因和跨膜转录激活蛋白（toxR）基因为靶目标，针对基因特异性区域设计引物进行PCR检测，结果仅对需钠弧菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒由下列物品组成:1)阴性对照，成份为 1mL 灭菌双蒸水 1 支 ;2)阳性对照，试剂成份为溶于1mL灭菌双蒸水中100ng的需钠弧菌（

【技术特征摘要】
1.一种三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒由下列物品组成:1)阴性对照，成份为1mL灭菌双蒸水1支;2)阳性对照，试剂成份为溶于1mL灭菌双蒸水中100ng的需钠弧菌（Vibrionatriegens）XA1菌株DNA1支；3)含Mg2+、dNTP和DNA聚合酶的PCR缓冲液1支；4)引物对toxR-F/toxR-RtoxR-F为：5'-AATCCGCTTTCCTCTGTT-3'1支；toxR-R为：5'-GGCGTTAGCACAGGTACA-3'1支；5)引物对Vhh-F/Vhh-RVhh-F：5'-AATGTCATCCGCCAACGA-3'1支；Vhh-R：5'-CCGTCAGGCGAATCAATG-3'1支；6)灭菌双蒸水1支；7)包装盒子，一块泡沫板，其大小与包装盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中；将阳性对照单独存放；试剂盒于-20°C保存。2.根据权利要求1所述的一种三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测试剂盒，其特征在于，引物设计的设计方法如下：参照GenBank上收录需钠弧菌的溶血素vhh基因序列DQ663483和跨膜转录激活蛋白toxR基因序列JF930637设计两对引物。3.一种三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述的试剂盒进行三疣梭子蟹需钠弧菌病原双重PCR检测方法；检测前准备细菌基因组提取试剂盒；检测步骤如下：（1）DNA模板的提取：将1mL过夜培养的需钠弧菌（Vibrionatriegens）XA1菌液，12,000g离心1min，尽量弃上清；加入100μLLB11和20μL蛋白酶K，震荡至菌体彻底悬浮；55°C孵育20min；加入20μLRNaseA混匀静置2min；加入400μLBB11涡旋30s；将全部液体加入离心柱中，12,000g离心30s，弃流出液；加入500μLCB11，12,000g离心30s，弃流出液；再加入500μLCB11，12,000g离心30s，弃流出液；加入500μLWB11，12000g离心30s，弃流出液；...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕可然，
申请(专利权)人：淮海工学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32