用于二代测序的接头制造技术

本发明专利技术公开了用于二代测序的接头。本发明专利技术公开的接头由两条名称分别为A链和B链的单链DNA组成或由名称分别为C链和D链的单链DNA组成；A链从5′端至3′端如式(Ⅰ)所示：A1‑A3‑A2式(Ⅰ)；A3的每个核苷酸均为A、T、C或G；B链从3′端至5′端如式(Ⅱ)所示：B1‑B2式(Ⅱ)；A2与B2互补；A1与B1不互补；A3与B1及A1均不互补；A1和A2的序列不同；B1与B2的序列不同；C链由A1与A2组成；D链由B1、B2与A3组成。实验证明，本发明专利技术的接头能够简单高效的实现降低二代测序中的假阳性突变，从而更灵敏的对肿瘤异质性样本、嵌合体样本等异质性混合样本中的低频突变进行检出。

Connector for two generation sequencing

A connector for a two generation sequencing is disclosed. The invention discloses a joint is composed of two names respectively for single stranded DNA A chain and B chain consisting of or consisting of names respectively for single stranded DNA C chain and D chain; A chain from the 5 'end and 3' end of formula (I) shown: A1 A3 A2 (I) each; the nucleotides A3 were A, T, C or G; B chain from the 3 'end and 5' end of formula (II) shown: B1 B2; (II) A2 and B2 A1 and B1 are complementary; complementary; A3 and B1 and A1 are not complementary sequences of A1 and A2; different sequences of B1 and B2; C; chain composed of A1 and A2; D chain is composed of B1, B2 and A3. Experiments show that the joint of the invention can efficiently reduce the two generation sequencing of false positive mutations, which is more sensitive to the heterogeneity of tumor samples, sample block low frequency compound heterogeneity in mixed sample mutations were detected.

【技术实现步骤摘要】
用于二代测序的接头
本专利技术涉及生物
中，用于二代测序的接头。
技术介绍
二代测序技术本身的错误率约为1％，这对于某些应用(例如遗传疾病致病基因、SNP位点检测等)是可以接受的，但是对于宏基因组学、古生物基因组学、癌症等研究领域是非常大的阻碍，这些涉及深度测序、复杂异质性样本需要检测小于1％的稀有突变，而二代测序1％的背景突变使得小于1％的稀有突变无法识别，所以目前急需一种更为精确的测序方法以满足现在测序的需要。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何提高测序准确率。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了用于制备二代测序接头的成套试剂。本专利技术所提供的用于二代测序的成套试剂，为成套试剂甲或成套试剂乙；所述成套试剂甲由两条名称分别为A链和B链的单链DNA组成；所述A链从5′端至3′端如式(Ⅰ)所示：A1-A3-A2式(Ⅰ)；所述A3的每个核苷酸均为A、T、C或G；所述B链从3′端至5′端如式(Ⅱ)所示：B1-B2式(Ⅱ)；所述成套试剂乙由两条名称分别为C链和D链的单链DNA组成；所述C链由所述A1与所述A2组成，所述C链从5′端至3′端如式(Ⅲ)所示：A1-A2式(Ⅲ)；所述D链由所述B1、所述B2与所述A3组成，所述D链从3′端至5′端如式(Ⅳ)所示：B1-A3-B2式(Ⅳ)；所述A2与所述B2互补；所述A1与所述B1不互补；所述A3与所述B1及所述A1均不互补；所述A1和所述A2的序列不同；所述B1与所述B2的序列不同。所述A3为随机序列，故，所述成套试剂甲中所述A链的种类和所述成套试剂乙中所述D链的种类由所述A3的种类数决定。其中，所述互补的定义为两条单链DNA长度相同时可以完全配对，两条单链DNA长度不同时长度短的单链DNA能完全与长度长的单链DNA的一部分序列完全配对。所述不互补包括除所述互补外的所有情况。上述成套试剂中，所述A链与所述B链可独立包装，也可包装在一起。所述A链与所述B链的配比可为1:1。所述C链和所述D链可独立包装，也可包装在一起。所述C链和所述D链的配比可为1:1。上述成套试剂在二代测序中进行应用时，可先使所述A链的A2与所述B链的B2进行配对形成Y型DNA片段或使所述C链的A2与所述D链的B2进行配对形成Y型DNA片段，再利用所述Y型DNA片段进行下一步的文库构建。在本专利技术的一个实施例中，所述Y型DNA片段为图1中A所示的DNA片段。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了用于二代测序的DNA片段。本专利技术所提供的二代测序的DNA片段为下述G1)或G2)：G1)通过尿嘧啶核苷酸连接所述A链的5′端与所述B链的3′端得到的DNA片段；G2)通过尿嘧啶核苷酸连接所述C链的5′端与所述D链的3′端得到的DNA片段。上述DNA片段在二代测序中进行应用时，可先使所述DNA片段的A2与B2进行配对形成U型DNA片段，再利用所述U型DNA片段作为接头进行下一步的文库构建。在本专利技术的一个实施例中，所述U型DNA片段为图1中B所示的DNA片段。上述文中，所述A3的长度可为H1)或H2)：H1)8-18nt；H2)14nt。所述B链与所述C链的序列均可为Illumina接头的序列。所述A1的长度可为15-25nt，如22nt。所述A1可为所述Illumina接头的Rd1SP的3′端第一位核苷酸开始的任意片段或Rd1SP的全长。所述A1具体可为所述Rd1SP3′端的22个核苷酸。所述B1的长度可为15-25nt，如22nt。所述B1可为与所述Illumina接头的Rd2SP的3′端第一位开始的任意片段或Rd2SP的全长互补的序列。所述B1具体可为与所述Rd2SP的3′端第一位开始的24个核苷酸互补的序列。所述A2和所述B2均可不为Illumina接头的序列，所述A2用于平衡所述A链中四种核苷酸的比例，使所述A链中的四种核苷酸的比例基本一致；所述B2用于平衡所述D链中四种核苷酸的比例，使所述D链中的四种核苷酸的比例基本一致。所述Illumina接头为利用Illumina测序平台测序所用到的接头(Adapter)。所述接头具体可为Y型接头或U型接头。所述Y型接头中组成所述接头的两条单链DNA部分互补。所述Y型接头中互补部分的长度为10-15nt，如13nt。所述U型接头为一条单链核酸分子，所述核酸分子5′端的10-15nt(13nt)与3′端的10-15nt(13nt)互补。所述A2中3′末端核苷酸可为硫代核苷酸。所述B2中5′末端核苷酸可为磷酸化修饰的核苷酸。所述A1与所述B1可通过尿嘧啶核苷酸相连。所述A1的序列具体可为序列表中序列1的第1-22位；所述A2的序列具体可为序列表中序列1的第37-50位；所述A3的序列具体可为序列表中序列1的第23-36位；所述B1的序列具体可为序列表中序列2的第14-37位；所述B2的序列具体可为序列表中序列2的第1-13位。所述A链的序列具体可为序列表中序列1。所述B链的序列具体可为序列表中序列2。所述DNA片段的序列具体可为序列表中序列3。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了下述R1)或R2)：R1)所述成套试剂的制备方法，包括：依次连接所述A1、所述A3和所述A2得到所述A链，依次连接所述B1和所述B2得到所述B链，将所述A链和所述B链分别包装得到所述成套试剂；R2)所述DNA片段的制备方法，包括：通过尿嘧啶核苷酸连接中所述A链的5′端与所述B链的3′端或通过尿嘧啶核苷酸连接所述C链的5′端与所述D链的3′端得到所述DNA片段。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了二代测序DNA文库的构建方法。本专利技术所提供的二代测序DNA文库的构建方法，包括：对待测样本的目的DNA连接作为接头的所述成套试剂或所述DNA片段，得到所述DNA文库。上述方法中，对所述目的DNA连接所述成套试剂或所述DNA片段可通过T4连接酶进行。上述方法还可包括在对所述目的DNA连接所述成套试剂或所述DNA片段前对所述目的DNA进行末端补齐和加A；所述末端补齐与所述加A在同一反应体系中进行，具体可利用KapaBiosystems的KAPAHyperPrepKits进行。KAPAHyperPrepKits的为货号可为KK8504。解决上述技术问题，本专利技术还提供了二代测序的方法。本专利技术所提供的二代测序的方法，包括：对待测样本按照所述二代测序DNA文库的构建方法建立DNA文库，利用Illumina测序平台进行测序，将测序结果中满足如下M1)、M2)和M3)的多条测序序列合并为一条序列，将合并后的序列命名为HF序列，即得到待测样本的测序结果；M1)所述多条测序序列为大于等于4条测序序列；M2)所述多条测序序列的所述A3序列均相同；M3)所述多条测序序列具有75％或75％以上的同一性。将所述多条测序序列合并为一条序列具体可按照如下方法进行：如果所述多条测序序列在相同位置的核苷酸不同，将占比超过50％(进一步可为75％)的核苷酸确定为HF序列相应位置的核苷酸；如果所述多条测序序列在相同位置的核苷酸相同，则该核苷酸即为HF序列相应位置的核苷酸。上述二代测序的方法中，所述方法还可包括对建立得到的DNA文库进行富集。所述富集可通过PCR扩增进行，所述PCR扩增所用引物可为Illumina测序平台中常用引物，只本文档来自技高网...

【技术保护点】
成套试剂，为成套试剂甲或成套试剂乙；所述成套试剂甲由两条名称分别为A链和B链的单链DNA组成；所述A链从5′端至3′端如式(Ⅰ)所示：A1‑A3‑A2式(Ⅰ)；所述B链从3′端至5′端如式(Ⅱ)所示：B1‑B2式(Ⅱ)；所述成套试剂乙由两条名称分别为C链和D链的单链DNA组成；所述C链由所述A1与所述A2组成，所述C链从5′端至3′端如式(Ⅲ)所示：A1‑A2式(Ⅲ)；所述D链由所述B1、所述B2与所述A3组成，所述D链从3′端至5′端如式(Ⅳ)所示：B1‑A3‑B2式(Ⅳ)；所述A3的每个核苷酸均为A、T、C或G；所述A2与所述B2互补；所述A1与所述B1不互补；所述A3与所述B1及所述A1均不互补；所述A1和所述A2的序列不同；所述B1与所述B2的序列不同。

【技术特征摘要】
1.成套试剂，为成套试剂甲或成套试剂乙；所述成套试剂甲由两条名称分别为A链和B链的单链DNA组成；所述A链从5′端至3′端如式(Ⅰ)所示：A1-A3-A2式(Ⅰ)；所述B链从3′端至5′端如式(Ⅱ)所示：B1-B2式(Ⅱ)；所述成套试剂乙由两条名称分别为C链和D链的单链DNA组成；所述C链由所述A1与所述A2组成，所述C链从5′端至3′端如式(Ⅲ)所示：A1-A2式(Ⅲ)；所述D链由所述B1、所述B2与所述A3组成，所述D链从3′端至5′端如式(Ⅳ)所示：B1-A3-B2式(Ⅳ)；所述A3的每个核苷酸均为A、T、C或G；所述A2与所述B2互补；所述A1与所述B1不互补；所述A3与所述B1及所述A1均不互补；所述A1和所述A2的序列不同；所述B1与所述B2的序列不同。2.DNA片段，为下述G1)或G2)：G1)通过尿嘧啶核苷酸连接权利要求1中所述A链的5′端与所述B链的3′端得到的DNA片段；G2)通过尿嘧啶核苷酸连接权利要求1中所述C链的5′端与所述D链的3′端得到的DNA片段。3.根据权利要求1所述的成套试剂或权利要求2所述的DNA片段，其特征在于：所述A3的长度为H1)或H2)：H1)8-18nt；H2)14nt。4.根据权利要求1所述的成套试剂，或权利要求2所述的DNA片段，或权利要求3所述的成套试剂或DNA片段，其特征在于：所述B链与所述C链的序列均为Illumina接头的序列；和/或，所述A2中3′末端核苷酸为硫代核苷酸；和/或，所述B2中5′末端核苷酸为磷酸化修饰的核苷酸。5.根据权利要求1所述的成套试剂，或权利要求2所述的DNA片段，或权利要求3或4所述的成套试剂或DNA片段，其特征在于：所述A1为所述Illumina接头的Rd1SP的3′端第一位开始的任意片段或Rd1SP的全长；所述B1为与所述Illumina接头的Rd2SP的3′端第一位开始的任意片段或Rd2SP的全长互补的序...

【专利技术属性】
技术研发人员：伍建，姬晓雯，
申请(专利权)人：北京迈基诺基因科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11