一种表面活性剂‑酶纳米复合催化剂的制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种表面活性剂‑酶纳米复合催化剂的制备方法与应用。该方法包括：配制0.01‑1mmol/mL表面活性剂水溶液，室温下，边搅拌边滴加游离酶水溶液至澄清，得混合液；将混合液边搅拌边滴加至0.01‑1 mmol金属离子盐溶液，室温下搅拌反应30‑60 min后得表面活性剂‑酶的纳米复合催化剂水溶液；将表面活性剂‑酶的纳米复合催化剂水溶液离心，并用去离子水冲洗1‑3次，洗去未吸附的游离酶，真空冷冻干燥至恒重即可。本发明专利技术采用水相溶液混合法制备，操作简单、周期短、条件温和、成本低廉、酶稳定性高、酶活收率高、载体酶分子结合强度高，尤其适合在水油两相生物催化中的应用。

Preparation method and application of surfactant enzyme nano composite catalyst

Preparation and application of the invention discloses a surfactant enzyme nano composite catalyst. The method comprises: preparing 0.01 1mmol/mL surfactant in aqueous solution, at room temperature, stirring, adding free enzyme aqueous solution to clarify the mixed solution; the mixture stirring dropping to 0.01 1 mmol metal salt solution, 30 60 min stirring at room temperature after the water nano composite catalyst solution surface active agent enzyme; nano composite catalyst in aqueous solution of surfactant centrifugal enzyme, and rinse with deionized water 1 3 times, wash away the free enzyme adsorption, vacuum freeze drying to constant weight. The invention adopts the aqueous solution prepared by mixing, simple operation, short period, mild condition, low cost, high stability, enzyme activity, enzyme carrier high yield with high intensity, especially suitable for application in the oil and water two phase biocatalysis in.

【技术实现步骤摘要】
一种表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法与应用
本专利技术属于酶的固定化
，具体涉及一种表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法与应用。
技术介绍
酶是一类高效专一的生物催化剂，因其具有专一性强、反应条件温和、低污染、催化效率高等优点，在医药、食品、轻工、化工、环保、能源、生物工程等领域有越来越重要的地位。但游离酶由于蛋白结构的不稳定性，极易受外界环境条件的影响而失去催化活性，且回收难、分散性差、难以连续使用，致使其在实际应用中受到很大限制，固定化酶技术的出现克服了上述游离酶的缺点，而且在实际应用中保留了酶原有的催化特性，甚至对酶的稳定性、分散性及酶的催化活性有显著提高。因此，通过设计和制备高效稳定的固定化酶催化剂，提高酶在实际应用过程中的活性、稳定性和可操作性，是生物
重要的研究内容之一，受到学术界和工业界的广泛关注。传统固定化酶一般将酶分子固定化在常规载体材料上，但由于常规载体材料对酶的底物存在较大的传质阻力，传统固定化的表现活性较低。纳米技术为酶固定化这一生物技术传统领域注入了新的活力。高比表面积、较小的传质阻力和丰富的功能性可使得纳米固定化酶催化剂具有高活性和稳定性。申请号201610236689.7的中国专利公开了一种酶-金属离子纳米复合物及其制备方法，该方法通过控制水溶液中金属离子和酶的浓度形成水溶液中可溶的500nm~1200nm的纳米复合物，经干燥即得酶-金属离子纳米复合物。本专利技术方法操作简单，成本低廉，纳米复合物中酶的稳定性得到显著提高，但酶活基本没有变化，且固定化周期长。申请号201210390877.7的中国专利公开了一种纳米介质材料的制备方法，以及以该纳米介质材料为载体的固定化酶，该制备方法是常温下，以可进行溶胶-凝胶反应的金属氧化物前驱体为原料与盐酸、水发生缩聚反应的预水解凝胶，通过加碱调pH后加模板剂，室温干燥至恒重即得纳米介质材料，然后以该纳米介质材料为载体实现酶的固定化。上述及现有的纳米固定化酶催化剂的主要形式是在纳米载体表面或者内部结合酶分子，所制备的纳米固定化酶仍然会给酶催化过程带来一定的底物传质阻力，影响酶的表观活性。采用常温水相表面活性剂-酶-金属离子快速共沉淀固定化酶，相比有机相共沉淀固定化制备的纳米复合体而言，水相体系减少对酶的伤害，使得酶保留更高的催化活性，相比传统的合成材料后固定化酶，共沉淀明显提高酶的蛋白固载量，该表面活性剂-酶纳米复合催化剂兼具酶的生物催化活性和表面活性剂的物理催化活性。因此，采用简便、低成本、绿色、条件温和的方法制备纳米固定化酶的研究十分重要。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法与应用，该方法采用水相溶液混合法制备，操作简单、周期短、条件温和、成本低廉、酶稳定性高、酶活收率高、载体酶分子结合强度高，兼备生物和物理催化活性。为解决现有技术问题，本专利技术采取的技术方案为：一种表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法，包括以下步骤：步骤1，表面活性剂改性游离酶配制0.01-1mmol/mL表面活性剂水溶液，室温下，边搅拌边以1mL/s的滴加速率滴加游离酶水溶液至澄清，得混合液；步骤2，制备表面活性剂-酶的纳米复合催化剂将混合液边搅拌边滴加速率加至0.01-1mmol金属离子盐溶液，室温下搅拌反应30-60min后得表面活性剂-酶的纳米复合催化剂水溶液；步骤3，将表面活性剂-酶的纳米复合催化剂水溶液离心，并用去离子水冲洗1-3次，洗去未吸附的游离酶，真空冷冻干燥至恒重即可。作为改进的是，所述表面活性剂为脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、甘氨脱氧胆酸纳和鹅脱氧胆酸钠中任一种。作为改进的是，所述金属离子为Co2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Ba2+、Cu2+、Ni2+、Sn2+、Mg2+中任一种。作为改进的是，所述游离酶为南极假丝酵母脂肪酶A、南极假丝酵母脂肪酶B、褶皱假丝酵母脂肪酶、猪胰脂肪酶、疏棉状嗜热丝抱菌脂肪酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶中一种或多种组合，所述游离酶水溶液中游离酶与水的质量比为0.1~1:50。作为改进的是，步骤1和步骤2中搅拌速度为100~150rpm。作为改进的是，步骤1中所述游离酶水溶液的添加量为0.005~1mL/mL。作为改进的是，步骤3中离心5~15min，离心时转速为4000~8000rpm，真空冷冻干燥的真空度为1.3~13Pa，温度为（-85）~（-10）℃。基于上述所得表面活性剂-酶纳米复合催化剂在水油两相生物催化中的应用。与现有技术相比，本专利技术制备方法操作简单、周期短、成本低廉、反应条件温和、载体酶分子结合强度高。本专利技术中表面活性剂-酶纳米复合催化剂以沉淀的形式生成，提高了纳米复合催化剂中酶的稳定性和活性，同时兼具生物和物理催化活性，尤其适合用于水相催化、有机相催化、两相催化反应领域。附图说明图1为实施例1中脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-Co2+纳米复合催化剂的扫描电镜图；图2为实施例4甘氨脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-Mn2+纳米复合催化剂的扫描电镜图；图3为实施例1脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-Co2+纳米复合催化剂与天然游离酶的相对酶活对比图；图4位实施例1中脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-Co2+纳米复合催化剂与假丝酵母脂肪酶水解葵花籽油生成的脂肪酸含量。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到，另外，蛋白酶活性的测定方法：以2%(w/v)酪蛋白（0.05mol/LTris-HCl缓冲液，pH8.0）为底物，将酶和底物分别于反应前都置于40℃保温10min，取0.2mL底物加入到0.2mL适度稀释的酶液上清中，置于40℃水浴中反应10min后，加入0.4mL终止反应液（三氯乙酸18g/L）,室温下静置15min，12000rpm离心20min，取上清置于紫外分光光度计中测定280nm处吸光值，以反应零时加入终止反应液的样品为空白对照。每单位（U）蛋白酶活定义为,在40℃条件下，1mg酶蛋白每分钟催化2%（w/v）酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为一个酶活单位（U/mg）。实施例1一种脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-Co2+纳米复合催化剂的制备方法，包括以下步骤：步骤1，表面活性剂改性游离酶配制0.1mmol/mL脱氧胆酸水溶液10mL，室温下，以120rpm速度边搅拌边以1mL/s的滴加速率滴加20mg/mL假丝酵母脂肪酶水溶液2mL，搅拌至澄清，得混合液；步骤2，制备表面活性剂-酶的纳米复合催化剂将混合液边搅拌边以1mL/s的滴加速率加至0.2mmol六水合氯化钴水溶液，室温下以120rpm的速度搅拌反应30min后得脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-Co2+纳米复合催化剂水溶液；步骤3，将脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-Co2+纳米复合催化剂水溶液用8000rpm的速度离心，并用去离子水冲洗2次，洗去未吸附的游离酶，真空冷冻干燥至恒重即可。本实施例制备的脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-Co2+纳米复合催化剂在电镜下的扫描图如图1所示，从图中可以看出，该催化剂为500nm左右的球状体。通过Bardford法测离心后的上清液中的剩余蛋白浓度的方式，测得该催化剂的酶蛋白负载量为1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表面活性剂‑酶纳米复合催化剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，表面活性剂改性游离酶配制0.01‑1 mmol/mL表面活性剂水溶液，室温下，边搅拌边滴加游离酶水溶液至澄清，得混合液；步骤2，制备表面活性剂‑酶的纳米复合催化剂将混合液边搅拌边滴加至0.01‑1 mmol金属离子盐溶液，室温下搅拌反应30‑60 min后得表面活性剂‑酶的纳米复合催化剂水溶液；步骤3，将表面活性剂‑酶的纳米复合催化剂水溶液离心，并用去离子水冲洗1‑3次，洗去未吸附的游离酶，真空冷冻干燥至恒重即可。

【技术特征摘要】
1.一种表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，表面活性剂改性游离酶配制0.01-1mmol/mL表面活性剂水溶液，室温下，边搅拌边滴加游离酶水溶液至澄清，得混合液；步骤2，制备表面活性剂-酶的纳米复合催化剂将混合液边搅拌边滴加至0.01-1mmol金属离子盐溶液，室温下搅拌反应30-60min后得表面活性剂-酶的纳米复合催化剂水溶液；步骤3，将表面活性剂-酶的纳米复合催化剂水溶液离心，并用去离子水冲洗1-3次，洗去未吸附的游离酶，真空冷冻干燥至恒重即可。2.根据权利要求1所述的一种表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂为脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、甘氨脱氧胆酸纳、鹅脱氧胆酸钠中任一种。3.根据权利要求1所述的一种表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法，其特征在于，所述金属离子为Co2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Ba2+、Cu2+、Ni2+、Sn2+、Mg2+中任一种。4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈可泉，倪艳，曹逊，李辉，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32