一种基于液体活检的肝癌检测的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种基于液体活检的肝癌检测的试剂盒，包括：用于增强染色效果的染色增强液和带荧光染色标记的特异性抗体；其中所述特异性抗体包括：ASGPR1抗体、CD45抗体和CPS1抗体；所述染色增强液包括浓度为0.001～1mg/mL的表面活性剂。本发明专利技术的试剂盒可以有效的富集目标细胞，并且确认富集的目标细胞是否来源于肝癌的早期患者。同时，本发明专利技术通过双瘤标检测增加肿瘤检测灵敏度并且进一步通过CEP8的检测保证检测的准确性。此外，本发明专利技术通过染色增强液加强染色效果，使多种带荧光染色标记的抗体都可以与目标细胞结合，对目标细胞染色，染色效果更好，荧光更强，而且边界清晰。

【技术实现步骤摘要】
一种基于液体活检的肝癌检测的试剂盒
本专利技术涉及液体活检领域，具体地说是一种基于液体活检的肝癌检测的试剂盒。
技术介绍
肝癌作为一种常见的癌症，与其它癌症相比，其在全世界范围内发病率位居第五，而死亡率位居第三。在我国，肝癌的发病率和死亡率均要高于世界水平。据统计，每年平均每十万人口就有近30人被诊断为肝癌患者，而每年平均每十万人口中就有26人死于肝癌，仅低于排在首位的肺癌死亡人数。因而，对于肝癌的早期筛查以及疾病发展过程中的检测就显得尤为重要。在这一方面，基于循环肿瘤细胞(CTC)检测的方法具有众多传统检测方法所没有的优势，包括无创、快捷和适用于早期筛查等。CTC是指自发或因诊疗操作由实体瘤原发灶或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。由于转移是癌症相关死亡的主要原因，而CTC作为转移的种子，在新的肿瘤生物标志物的发现、肿瘤预后判断及个体化治疗方面存在很大的应用潜力，是国内外肿瘤研究的热点之一。据统计，40％的肝癌患者在治疗后一年内就会复发，研究指出血液中CTC的阳性率与肝癌的预后复发和低的生存期相关。所以，较高的死亡率和复发风险就更加突出了CTC早期检测的重要性。到目前为止，对于肝癌CTC的检测主要依赖于EpCAM的CTC捕获、富集分析平台，基于此CTC阳性检出率可以达到约40％。虽然基于EpCAM的CTC捕获富集仍然被作为肝癌中CTC检测的金标准，但有以EpCAM为生物标志物对于发生EMT的CTC的检测仍存在很高的假阴性。此外，EpCAM这一广谱的上皮生物标志物不仅不适合用于肿瘤早期的检测，而且也不具有组织特异性，无法追溯CTC的具体组织来源，而这一点对于后续的肿瘤治疗具有重要意义。因此，发现并应用一些CTC组织特异性的生物标志物进行CTC的早期筛查及检测分析显得尤为重要。据已有研究显示，有包括EpCAM、CK家族蛋白、MUC1等众多生物标志物被用于肝癌CTC的检测分析，其中以脱唾液酸糖蛋白受体1(ASGPR1)和氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)作为标志物不仅具有较高的CTC阳性检出率，而且还具有很高的肝组织特异性。有研究基于ASGPR1-磁珠用于肝癌CTC的捕获，结果显示高于80％的肝癌患者中存在ASGPR1+的CTC，联合CPS1后，其CTC阳性检测率可以达到91％。而针对于CPS1，联合CK的CTC阳性检出率为89％，而且其在肝组织中也具有较高的特异性。据此，联合ASGPR1和CPS1作为肝癌CTC早期筛查的生物标志物，不仅可以将检测的灵敏度最大化，而且还可以据此判定早期筛查样品中CTC的具体组织来源。公告日为2014年1月15日，公告号为CN102313813B的中国专利中公开了一种通过免疫荧光染色对稀有细胞进行检测的方法，该方法对白细胞、稀有细胞和细胞核进行三色染色，再通过荧光检测。但是该方法仅能通过一种单抗来特异性识别该稀有细胞，容易造成漏检。同时，由于细胞的异质性，每个细胞表达的抗原(抗体)量不一，导致有时荧光强度非常微弱，在荧光显微镜下难以分辨。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是针对现有技术存在的不足提供一种基于液体活检的肝癌检测的试剂盒，利用该试剂盒可以检测外周血中CTC的数量，判断该CTC是否来源于肝癌，区分检出的早期肝癌CTC的类型，而且检测结果准确，误差小。在本专利技术的一方面，本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种基于液体活检的肝癌检测的试剂盒，所述试剂盒包括：用于增强染色效果的染色增强液和带荧光染色标记的特异性抗体；其中所述特异性抗体包括：ASGPR1抗体、CD45抗体和CPS1体；所述染色增强液包括浓度为0.001～1mg/mL的表面活性剂。所述染色增强液的溶剂为生物缓冲液。优选的，所述表面活性剂可以为TritonX-100、二甲基亚砜、NP-40、十二烷基硫酸钠(SDS)中的任一种。更优选的，所述表面活性剂为TritonX-100或SDS。最优选的，所述染色增强液包括浓度为0.01～1mg/mL的SDS，染色增强液的溶剂为常用的生物缓冲液，如PBS缓冲液等。优选的，所述试剂盒中还包括淋巴细胞分离液和用于去除白细胞的免疫磁珠。淋巴细胞分离液和免疫磁珠能够用于去除红细胞和白细胞的干扰，便于更好的富集CTC。更优选的，所述用于去除白细胞的免疫磁珠为表面偶联有抗体CD45、CD14和CD15的免疫磁珠中的一种或多种，最优选包括全部的上述免疫磁珠。优选的，所述特异性ASGPR1抗体、CD45抗体和CPS1抗体的荧光染色标记具有各自不同的发射波长。根据本领域技术人员公知的，为了区分不同的特异性抗体，本专利技术应当采用不同的荧光染色标记。标记染料可以采用本领域任何常用的荧光染料，只要通过调节激发光波长可区分即可。由于荧光染色标记的发射波长各自不同，因此通过荧光显微镜在不同的滤光片下可以完全区分开。本专利技术优选采用的荧光染色标记为AlexaFluor系列分子、花青染料。更优选为Alexa594、CY5和Alexa488，其中Alexa594发射波长为618nm，CY5发射波长为670nm，Alexa488发射波长为519nm。其中带荧光染色标记的CD45抗体优选为CD45-Alexa594(红色)、带荧光染色标记的ASGPR1抗体可以为ASGPR1-Alexa488(绿色)或ASGPR1-CY5(肉眼不可见，显微镜扫描赋以紫色)、带荧光染色标记的CPS1抗体为CPS1-CY5(肉眼不可见，显微镜扫描赋以紫色)或CPS1-Alexa488(绿色)。所述用于荧光原位杂交的荧光探针可以为用于染色体荧光原位杂交的探针，如CEP8荧光探针。优选的，所述染色增强液中还包括占染色增强液质量百分含量0.1～3％的聚乙二醇。聚乙二醇与表面活性剂配合可以进一步加强染色液的染色效果。作为本领域技术人员公知的，将带荧光染色标记的特异性抗体与细胞进行孵育从而进行荧光染色的过程可以为液体染色或固体染色。如果进行液体染色则先将需要进行细胞染色的细胞重悬成细胞悬液，然后依次进行染色预处理、细胞染色，再将细胞转移到载玻片上进行细胞固定、载玻片封片。而如果在载玻片上进行固体染色，则先将细胞在载玻片上进行细胞固定，然后依次进行染色预处理、细胞染色后，再对载玻片封片。上述细胞固定是通过细胞固定液进行的，所述细胞固定液可以为本领域常用的细胞固定液，例如多聚甲醛、戊二醛、福尔马林、乙醇、丙酮中的一种或几种的组合。一种利用上述基于液体活检的肝癌检测的试剂盒进行CTC检测的方法包括以下步骤：富集外周血中的目标细胞；利用染色增强液对目标细胞进行增强染色预处理；利用带荧光染色标记的特异性抗体对目标细胞进行荧光染色；目标细胞固定；用荧光探针进行荧光原位杂交(FISH)；DAPI封片及镜检。经过增强染色预处理之后的目标细胞，特异性抗体与目标细胞的结合更好，荧光染色更明显，细胞膜边界清晰。作为本领域技术人员公知的，当肿瘤细胞特异性抗原存在于细胞内时，应当对细胞膜表面染色并固定目标细胞后，再将细胞膜破膜并利用带荧光染色标记的特异性抗体对目标细胞进行细胞内荧光染色。优选的，所述富集外周血中的目标细胞包括以下步骤：(1)将外周血离心分离血浆和血细胞，并去除血浆；(2)向步骤(1)中加入细胞缓冲液和淋巴细胞分离液离心分层，去除红细胞层；(3)向步骤(2)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于液体活检的肝癌检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：用于增强染色效果的染色增强液和带荧光染色标记的特异性抗体；其中所述特异性抗体包括：ASGPR1抗体、CD45抗体和CPS1抗体；所述染色增强液包括浓度为0.001～1mg/mL的表面活性剂。

【技术特征摘要】
1.一种基于液体活检的肝癌检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：用于增强染色效果的染色增强液和带荧光染色标记的特异性抗体；其中所述特异性抗体包括：ASGPR1抗体、CD45抗体和CPS1抗体；所述染色增强液包括浓度为0.001～1mg/mL的表面活性剂。2.根据权利要求1所述的基于液体活检的肝癌检测的试剂盒，其特征在于：所述染色增强液的溶剂为生物缓冲液。3.根据权利要求1所述的基于液体活检的肝癌检测的试剂盒，其特征在于：所述表面活性剂选自TritonX-100、二甲基亚砜、NP-40、十二烷基硫酸钠中的任一种。4.根据权利要求1所述的基于液体活检的肝癌检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括淋巴细胞分...

【专利技术属性】
技术研发人员：段彪，陈昌岳，张培培，张祥林，冯丽娜，蔡红东，
申请(专利权)人：上海美吉医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31