一种以核酸适配体检测ATP的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供一种以核酸适配体检测ATP的试剂盒及其检测方法。所述的试剂盒，其包括序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核酸适配体以及四甲基罗丹明(TMR)标记的ATP。本发明专利技术基于核酸适配体的荧光偏振(荧光各向异性)对ATP实现检测，具有操作简单，检测迅速、灵敏度高、精确度高和重现性好的优点，不易受荧光强度波动、荧光漂白的影响。与色谱等方法相比，无需昂贵的仪器设备，操作步骤简单，只需要简单的样品混合就可进行测定。

【技术实现步骤摘要】
一种以核酸适配体检测ATP的试剂盒及其检测方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种以核酸适配体检测ATP的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
三磷酸腺苷(ATP)是生物体内重要的活性分子，发挥着多种功能。ATP是一种高能磷酸化合物，通过与二磷酸腺苷(ADP)的转化实现储能和放能，为细胞的生命活动提供能量。在细胞的生理功能中，ATP在调控细胞代谢和生物反应过程中起着关键作用。ATP还参与构建蛋白质分子、主动输运离子和神经电信号传导等多种生理功能。监测ATP可用于指示细胞的活性和细胞损伤。而且，ATP的含量也经常被用于测定微生物的活性、鱼的新鲜度等。ATP也在信号转导中有重要功能。因此，检测ATP分子在基础研究和生产实践等方面有重要意义，也有多方面的需求。ATP的常用检测方法包括基于酶反应的方法、色谱法、生物传感法等。荧光偏振(fluorescencepolarization)或荧光各向异性(fluorescenceanisotropy)分析具有重现性好、灵敏、操作简单、易于高通量分析等特点。荧光偏振分析/荧光各向异性分析采用偏振的激发光来激发荧光分子，测定偏振发射荧光在垂直方向的荧光强度I⊥和水平方向的荧光强度I∥，然后根据相应的公式计算出荧光偏振值或荧光各向异性值。荧光偏振值P等于(I∥-I⊥)/(I∥+I⊥)，而荧光各向异性值r等于(I∥-I⊥)/(I∥+2I⊥)。荧光偏振和荧光各向异性值是没有量纲的比值，因此不受荧光强度波动的影响，测定具有很好的精确性和重现性。荧光偏振分析/荧光各向异性分析中往往需要采用荧光染料标记分子，荧光染料标记分子在分子相互作用或反应中分子转动发生变化时会引起荧光偏振信号和荧光各向异性信号的变化。荧光偏振分析/荧光各向异性分析在分子间相互作用分析、临床药物检测、药物筛选、配体筛查等方面有重要的应用。常用的荧光偏振/荧光各向异性分析法检测小分子往往需要采用免疫抗体作为识别试剂构建检测方法，但免疫抗体在制备、稳定性、成本方面存在着局限性。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供一种以核酸适配体检测ATP的试剂盒及其检测方法，以期解决上述现有技术中存在的至少部分技术问题。为实现上述目的，本专利技术提供一种以核酸适配体检测ATP的试剂盒，其包括序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的核酸适配体以及四甲基罗丹明(TMR)标记的ATP。本专利技术还提供一种检测ATP的方法，其是将序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的核酸适配体、四甲基罗丹明标记的ATP与待测样本混合后温育，测定TMR的荧光各向异性变化值或荧光偏振变化值。与现有技术相比，本专利技术的积极进步效果在于：本专利技术基于核酸适配体的荧光偏振(荧光各向异性)对ATP实现检测，其不同于以往的传统的需要采用免疫抗体作为亲和配体的荧光偏振检测小分子的方法。免疫抗体的制备成本高，稳定性差，批间重现性差，易失活。核酸适配体序列可以通过化学方法合成制备、合成成本低、具有很好的热稳定性，便于储存和运输，货架寿命长，不易失活。荧光偏振分析方法具有操作简单，检测迅速、灵敏度高、精确度高和重现性好的优点，不易受荧光强度波动、荧光漂白的影响。与色谱等方法相比，无需昂贵的仪器设备，操作步骤简单，只需要简单的样品混合就可进行测定。附图说明图1显示TMR标记的ATP分子的结构示意图。图2显示实施例1中采用核酸适配体(AD25或AD25-10P)和TMR标记的ATP基于荧光各向异性检测ATP的结果，其显示荧光各向异性信号与ATP浓度间的关系，其中横坐标为ATP浓度(单位为μM)，纵坐标为荧光各向异性值r。图3显示实施例1中采用核酸适配体(AD25或AD25-10P)和TMR标记的ATP基于荧光偏振检测ATP的结果，其显示荧光偏振信号与ATP浓度间的关系，其中横坐标为ATP浓度(单位为μM)，纵坐标为荧光偏振值P。图4显示实施例2中采用AD25-10P和TMR标记的ATP基于荧光各向异性法检测稀释尿样中的ATP的结果，其显示荧光各向异性变化与ATP浓度的关系，其中横坐标为ATP浓度(单位为μM)，纵坐标为荧光各向异性值差值Δr(由ATP存在时对应的荧光各向异性值差值减去ATP不存在的空白样品对应的荧光各向异性值得到)。图5显示对比例1中采用核酸适配体AD25和TMR标记的ATP基于荧光各向异性检测ATP方法的选择性参考结果，其中横坐标对应不同的样品，纵坐标为所测得的荧光各向异性值减掉空白样品对应的荧光各向异性值得到荧光各向异性的变化值Δr。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本专利技术作进一步的详细说明。核酸适配体是从寡聚核苷酸文库中筛选得到的可高亲和力高选择性识别目标分子的单链核酸分子。核酸适配体的出现为检测ATP提供了新的研究手段。作为核酸类的亲和配体，核酸适配体在分析检测领域的应用具有很多优点，如合成制备方便，热稳定性高，易于引入功能团如荧光染料标记等。核酸适配体在亲和力和选择性方面都可以和免疫抗体相媲美，核酸适配体的分析方法可以克服免疫分析中免疫抗体的在稳定性和制备等方面的一些局限，显示出潜力，核酸适配体的应用也受到广泛的关注，在分析传感领域显示出很大的潜力和应用前景。本申请的专利技术人基于本领域的现状，经过大量的实验探究和反复的实践验证，终于发现序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的核酸适配体能够与ATP选择性作用，具有很强的亲和力，利用核酸适配体可以发展检测ATP的检测方法。本专利技术的原理是：荧光染料四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine，TMR)标记的ATP分子体积小，在溶液中快速转动，具有低的荧光各向异性(fluorescenceanisotropy)和荧光偏振(fluorescencepolarization)值，当四甲基罗丹明标记的ATP与DNA的核酸适配体结合时，由于分子体积增大和分子间的相互作用，四甲基罗丹明标记的ATP的转动变慢，产生高的荧光偏振值(荧光各向异性值)。当溶液中加入待测的ATP分子时，ATP将TMR标记的ATP从核酸适配体复合物中竞争置换下来，测得的荧光偏振(荧光各向异性)值降低，随着ATP浓度的增加，荧光偏振信号(荧光各向异性)逐渐下降直到达到平台期，溶液中TMR标记的ATP分子绝大部分变为未结合状态，根据信号的变化可以实现对ATP的检测。因ATP的类似物(腺苷、AMP、ADP)也可以与核酸适配体结合，这种方法还可以用于检测ATP的类似物腺苷、AMP和ADP。其他核苷酸分子如GTP，CTP，TTP，及其对应的碱基分子等存在时，不能产生信号的变化。本申请的专利技术人在研究中发现，通过延长适配体的序列可使适配体的分子体积变大，若在序列如SEQIDNO.1所示的适配体序列两端延长各10个碱基的序列，当TMR标记的ATP与其结合时可产生更高的荧光各向异性，当ATP存在时可使ATP产生的荧光各向异性变化更大，检测限可达到0.2μM。本专利技术提供的以核酸适配体检测ATP的试剂盒，其包括序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的核酸适配体以及四甲基罗丹明(TMR)标记的ATP。其中，所述TMR标记的ATP是指TMR染料标记到ATP分子的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以核酸适配体检测ATP的试剂盒，其包括序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核酸适配体以及四甲基罗丹明(TMR)标记的ATP。

【技术特征摘要】
1.一种以核酸适配体检测ATP的试剂盒，其包括序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的核酸适配体以及四甲基罗丹明(TMR)标记的ATP。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括ATP分子作为阳性对照。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pH为6～10的缓冲液，更优选地，所述缓冲液的pH为7.5，包括50mMTris-HCl和50mMMgCl2。4.一种检测ATP的方法，其是将序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的核酸适配体、四甲基罗丹明标记的ATP与待测样本混合后温育，测定TMR的荧光各向异性变化值或荧光偏振变化值。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述核酸适配体的使用浓度为5μM。6.根据权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵强，李亚飘，孙琳琳，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11