一种鉴别枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜的分析方法技术

本发明专利技术公开一种鉴别枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜的分析方法，具体是应用超高效液相色谱‑四极杆‑轨道阱高分辨质谱技术结合代谢组学方法，包括：将真枣花蜜样品和与待检测的糖浆掺假枣花蜜样品分别采用有机溶剂进行前处理后，应用超高效液相色谱‑四极杆‑轨道阱高分辨质谱方法实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到真枣花蜜样品与待测的枣花蜜样品的UHPLC‑MS原始数据进行预处理，最后应用多元统计分析方法主成分分析区分真枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜。本发明专利技术的方法是在对枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜的代谢物信息进行一个全面的获取后，结合多元统计分析，对枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜进行全面分析，完成对糖浆掺假枣花蜜的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜的分析方法
本专利技术属于食品掺假鉴别
，具体涉及一种应用UHPLC-QExactive联用的代谢组学技术鉴别枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜的分析方法。
技术介绍
蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质，蜂蜜营养价值高，但是由于蜂蜜较高的价格和较低的产量，使得蜂蜜成为不法商贩掺假的一个主要对象，为了提高蜂农的生产积极性、保障消费者的利益，为了支持正规蜂蜜生产企业的公平竞争、维护蜂蜜市场的秩序，促进我国蜂蜜产业的健康发展，因此对于找到真正蜂蜜样品的标志性代谢物，从而尝试建立一套灵敏、高效、准确的蜂蜜掺假鉴定方法具有非常重要的意义与价值。在真蜂蜜中掺入果葡糖浆、淀粉糖浆、大米糖浆等：这是目前最常用的蜂蜜掺假手段，由于这些糖浆的果糖和葡萄糖比例与蜂蜜中的成分非常相似，掺入后各项检测指标完全符合国家标准，给检测造成了很大的困难。目前常用于蜂蜜掺假进行鉴定的方法有稳定碳同位素比值分析法(SCIRA)、薄层色谱法(TIC)、脉冲电流检测器的高效阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)、气相色谱质谱联用技术(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相同位素质谱仪联用技术(HPLC-IRMS)、核磁共振技术(NMR)以及近红外光谱(NIRS)等。现有的方法对于测定蜂蜜掺假有许多弊端：稳定碳同位素比值分析法(SCIRA)这种方法只对天然蜂蜜中掺入C4植物糖有效，如果蜂蜜中掺入利用水稻、小麦、大豆等C3植物淀粉制备的糖类成分或利用水稻、小麦、大豆等C3植物淀粉制备的糖类物质与其他物质配制的全假蜂蜜，则难以鉴别。Kushnir等利用薄层色谱法测定玉米糖浆掺假的蜂蜜确定聚合度为12到19的多聚糖为蜂蜜掺假高果糖玉米糖浆和玉米糖浆的标志物。但是这种方法需要复杂的前处理过程来除去蜂蜜中的葡萄糖、果糖和少量寡糖，导致检测方法操作复杂。脉冲电流检测器的高效阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)法的局限性更大，在前期对寡糖和多聚糖的水解很可能造成假阳性结果，因为真蜂蜜中也有聚合度3-6的寡糖的存在。脉冲电流检测器的高效阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)则需要复杂的前处理过程来除去单糖和寡糖，前处理过程复杂。GC-MS法测定蜂蜜掺假也有一定的缺陷，在检测前需要对蜂蜜样本进行衍生化。核磁共振技术(NMR)灵敏度低，对于蜂蜜中我们所关注的代谢物可能会被忽略，并且核磁共振仪器价格昂贵，并不适用于日常监测。近红外光谱(NIRS)也有其致命的缺点：1.需要大量有代表性且化学值已知的样品建立模型。这样，对小批量样品的分析用近红外就显得不实际了。2.模型需要不断更新，由于仪器状态改变或标准样品发生变化，模型也要随之变化了。3.模型不通用，每台仪器的模型都不相同，增加使用的局限性。4.建模本钱高，测试用度大。现有的对蜂蜜品质进行鉴定的方法如GB14963-2011以及SN/T0852-2012：对蜂蜜的感官性状；理化指标如：果糖葡萄糖含量，蔗糖含量等方面进行检测；微生物指标，农残兽残，重金属，添加剂等方面也均进行检测。很多企业标准则对蜂蜜中的麦芽糖、果葡萄糖浆、可可粉，柠檬酸、诱惑红、焦糖色、山梨酸钾、卡拉胶、食用香精等进行测定。目前对蜂蜜掺假的各种糖浆，在理化性质，成分组成和含量以及风味方面与蜂蜜非常相似，因此上述对蜂蜜品质进行测定的方法并不能检测出糖浆掺假的蜂蜜。综上所述，目前现有技术中缺少一种对枣花蜜掺假进行鉴定的快速有效和直观明显的方法，也没有用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱联合代谢组学法测定枣花蜜标志性代谢物的有关研究。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种应用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱技术结合代谢组学方法鉴别枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜的分析方法，该分析方法能够有效鉴别真枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜。本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术的第一个目的是提供一种应用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱技术结合代谢组学方法判别枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜的分析方法，包括以下步骤：将真枣花蜜样品和与待检测的糖浆掺假枣花蜜样品分别采用有机溶剂进行前处理后，应用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱方法实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到真枣花蜜样品与待测的枣花蜜样品的UHPLC-MS原始数据进行预处理，最后应用多元统计分析方法主成分分析(PCA)模型区分真枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜。本专利技术的分析方法对于掺假枣花蜜所用的糖浆并没有特别限定，涵盖目前掺假所用的C3、C4糖浆所有种类，包括：大米糖浆、玉米糖浆、甜菜糖浆、复合果葡糖浆、网购蜂蜜专用糖浆或其它糖浆。作为一种优选方案，本专利技术中样品前处理中采用的有机溶剂是含有甲酸的甲醇和水的混合溶剂，其中，优选的，甲酸的体积分数为1％，甲醇和水为等体积混合形成混合溶剂。作为一种优选方案，本专利技术中的样品前处理过程包括：将样品与有机溶剂混合至样品完全溶解，超声，离心，过有机滤膜，得到可上机检测的样品。其中，超声时间为10～30min，优选25min；离心条件：800～1200rpm离心4～8min，优选1000rpm离心5min；有机滤膜的孔径为0.20～0.25μm，优选0.22μm；为保证样品中代谢物提取效果较好，样品与有机溶剂的添加比例为1g：(15～25)mL。在整个前处理过程，为了保证尽可能多的获取蜂蜜样品以及糖浆掺假枣花蜜样品的代谢物信息，提取试剂优先选用的是甲醇和水的混合溶剂(含少量甲酸)对测试样品进行溶解，超声后离心过有机滤膜即可上机检测，前处理步骤简单，易于操作。色谱的分离和质谱数据的采集是同时进行的，为了使每个化合物都得到分离和鉴定，必须选择合适的色谱和质谱分析条件。本专利技术针对枣花蜜样品以及糖浆掺假枣花蜜组分的特点，考察了超高效液相色谱中的流动相、梯度洗脱流程、柱温和进样量等条件对分离效率和分析速度的影响，最终优化筛选得到一组使得分析样品得到最佳分离效果的超高效液相色谱条件。作为一种优选方案，超高效液相色谱条件为：采用十八烷基键合硅胶柱(C18柱)；流动相：A相：乙腈，B相：醋酸铵水溶液(优选浓度为10mM)，梯度洗脱流程：0-2min1％A,2-3.25min1％-5％A，3.25-4.25min5％A,4.25-7.75min5％-55％A,7.75-9.75min55％-90％A,9.75-11.75min90％A,11.75-12min90％-1％A,12-15min1％A。流速：0.2～0.5mL/min(优选0.3mL/min)，柱温30～37℃(优选35℃)，进样量3微升。本专利技术针对枣花蜜样品以及糖浆掺假枣花蜜组分的特点，为改善化合物的雾化和电离状况，提高灵敏度，通过对分辨率、气体流速、喷雾电压等条件进行考察，最终优化筛选得到一组使得检测效果准确的四极杆-轨道阱高分辨质谱条件。作为一种优选方案，四极杆-轨道阱高分辨质谱选用ThermoFisherQExactiveMassSpectrometer，正谱条件为：分辨率，70000；鞘气流速，40个单位；辅助气流速，10个单位；反吹气流速，0个单位；喷雾电压，3.5kV；毛细管温度，320℃；辅助气温度，350℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种应用超高效液相色谱‑四极杆‑轨道阱高分辨质谱技术结合代谢组学方法鉴别枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜的分析方法，其特征是，包括以下步骤：将真枣花蜜样品和与待检测的糖浆掺假枣花蜜样品分别采用有机溶剂进行前处理后，应用超高效液相色谱‑四极杆‑轨道阱高分辨质谱方法实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到真枣花蜜样品与待测的枣花蜜样品的UHPLC‑MS原始数据进行预处理，最后应用多元统计分析方法主成分分析（PCA）模型区分真枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜。

【技术特征摘要】
1.一种应用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱技术结合代谢组学方法鉴别枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜的分析方法，其特征是，包括以下步骤：将真枣花蜜样品和与待检测的糖浆掺假枣花蜜样品分别采用有机溶剂进行前处理后，应用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱方法实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到真枣花蜜样品与待测的枣花蜜样品的UHPLC-MS原始数据进行预处理，最后应用多元统计分析方法主成分分析（PCA）模型区分真枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜。2.如权利要求1所述的分析方法，其特征是：所述糖浆包括大米糖浆、玉米糖浆、甜菜糖浆、复合果葡糖浆、网购蜂蜜专用糖浆或其它糖浆。3.如权利要求1所述的分析方法，其特征是：样品前处理中采用的有机溶剂是含有甲酸的甲醇和水的混合溶剂；优选的，甲酸的体积分数为1%，甲醇和水为等体积混合形成混合溶剂；优选的，样品前处理过程包括：将样品与有机溶剂混合至样品完全溶解，超声，离心，过有机滤膜，得到可上机检测的样品；其中，超声时间为10~30min，优选25min；离心条件：800~1200rpm离心4~8min，优选1000rpm离心5min；有机滤膜的孔径为0.20～0.25μm，优选0.22μm；样品与有机溶剂的添加比例为1g：（15~25）mL。4.如权利要求1所述的分析方法，其特征是：超高效液相色谱条件为：A相：乙腈，B相：醋酸铵水溶液，梯度洗脱流程：0-2min1%A,2-3.25min1%-5%A，3.25-4.25min5%A,4.25-7.75min5%-55%A,7.75-9.75min55%-90%A,9.75-11.75min90%A,11.75-12min90%-1%A,12-15min1%A；流速：0.2~0.5mL/min，柱温30~37℃；优选的，所述醋酸铵水溶液的浓度为10mM，流速为0.3mL/min，柱温35℃，进样量3微升。5.如权利要求1所述的分析方法，其特征是：正谱条件为：分辨率，70000；鞘气流速，40个单位；辅助气流速，10个单位；反吹气流速，0个单位；喷雾电压，3.5kV；毛细管温度，320℃；辅助气温度，350℃；扫描范围，m/z：70-1050；...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿越，宿书芳，江瑶，王骏，王凯利，祝建华，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37