大豆花粉育性的分子标记检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了大豆花粉育性的分子标记检测方法及其应用。本发明专利技术所提供的大豆花粉育性连锁分子标记检测包括：分别以待鉴定大豆、冀豆12和雄性不育突变体(pst1)的基因组DNA为模板，用名称为X1的PCR引物对进行PCR扩增：将冀豆12和pst1的PCR扩增产物的带型分别命名为A和B，如果待鉴定大豆的PCR扩增产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的带型为A，待鉴定大豆为花粉粒可育大豆，如果待鉴定大豆的PCR扩增产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的带型为B，待鉴定大豆为花粉粒败育大豆，如果待鉴定大豆的PCR扩增产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的带型为H(含有A和B的带型)，待鉴定大豆为花粉粒部分可育大豆。

Molecular marker method for detecting pollen fertility of soybean and its application

The invention discloses a molecular marker detecting method for soybean pollen fertility and an application thereof. The invention provides a great education including the chain Tofu pudding powder for molecular markers: identification of soybean Jidou 12, and male sterile mutant (pst1) genomic DNA as a template with the name PCR on X1 primer for PCR amplification: Jidou 12 and pst1 PCR band amplified products were named for A and B, if the identification of soybean PCR amplification in non denaturing polyacrylamide gel electrophoresis with A, to be identified for soybean pollen fertility of soybean, if the identification of soybean PCR amplification in non denaturing polyacrylamide gel electrophoresis with B, to be identified for soybean pollen abortion yo soy, if the identification of soybean PCR amplification in non denaturing polyacrylamide gel electrophoresis with type H (band containing A and B), to be identified as part of soybean pollen fertility of soybean.

【技术实现步骤摘要】
大豆花粉育性的分子标记检测方法及其应用
本专利技术涉及生物
中大豆花粉育性的分子标记检测方法及其应用。
技术介绍
雄性和雌性生殖器官在植物种子发育中起着非常重要的作用。雄蕊或雌蕊发育过程中相关基因的任何突变均可引起植物育性的改变。根据雌性与雄性配子育性的不同，将相关突变体划分为雌性-雄性不育、雄性不育-雌性可育、雄性可育-雌性不育。目前，大豆中已经鉴定出了多个雄性不育-雌性可育突变体(简称为雄性不育突变体)。杂种优势利用在玉米、水稻、高粱、油菜、花生、部分蔬菜等育种与生产中已获得巨大的生产效益，而大豆等部分作物仍以常规种生产为主。在最近的作物杂种优势利用国际会议上部分学者就利用雄性不育体系对大豆生产有着积极的杂种优势效应做了相关报告(Lietal.2012；Sun.2012,Yangetal.2012；Zongetal.2012)。大豆杂交品种培育在我国已有多年的育种实践，并取得了一定成绩。大豆是一个严格的自花授粉作物，需要在开花之前去除花药，依靠人工杂交手段获得大量大豆杂交种非常困难而且耗费时费力。如果获得一个不依赖于种植环境的雄性不育体系，将会极大地促进大豆杂交品种培育及大豆杂种优势利用。目前急需一种可以快速鉴定大豆花粉粒育性的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何鉴定大豆花粉粒育性。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了利用大豆花粉育性连锁分子标记10-0871及其对应的引物对X1(将用来得到分子标记10-0871的引物对命名为X1)鉴定或辅助鉴定大豆花粉粒育性的方法。本专利技术所提供的鉴定或辅助鉴定大豆花粉粒育性的方法，包括如下步骤：分别以待鉴定大豆、冀豆12和雄性不育突变体(pst1)的基因组DNA为模板，用名称为X1的PCR引物对进行PCR扩增，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所得到的PCR产物，按照下述方法确定所述待鉴定大豆的花粉粒育性：将冀豆12的PCR扩增产物的带型命名为A，将雄性不育突变体(pst1)的PCR扩增产物的带型命名为B，如果待鉴定大豆的PCR扩增产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的带型为所述A，所述待鉴定大豆为或候选为花粉粒可育大豆，如果待鉴定大豆的PCR扩增产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的带型为所述B，所述待鉴定大豆为或候选为花粉粒败育大豆，如果待鉴定大豆的PCR扩增产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的带型为H带型，所述H带型为含有所述A带型和所述B带型的带型，所述待鉴定大豆为或候选为花粉粒部分可育大豆；所述X1由SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的两条单链DNA组成。上述方法中，所述非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，所述非变性聚丙烯酰胺凝胶的浓度为6％，上述方法中，所述PCR扩增中的引物退火温度为55℃。上述方法中，所述PCR扩增中的引物退火条件为55℃30s。上述方法中，所述待鉴定大豆选自雄性不育突变体(pst1)×冀豆12的杂种后代中的F2及其以后世代的家系。上述方法中，所述花粉粒部分可育大豆是指单株大豆的可育花粉粒占该株花粉粒总数的比例为15-90％。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了所述的方法在大豆育种中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了所述方法在预测大豆花粉粒育性中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了鉴定或辅助鉴定大豆花粉粒育性的引物对。本专利技术所提供的鉴定或辅助鉴定大豆花粉粒育性的引物对，为所述X1。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了鉴定或辅助鉴定大豆花粉粒育性的系统。本专利技术所提供的鉴定或辅助鉴定大豆花粉粒育性的系统，包括所述引物对、进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器、和/或进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳所需的试剂和/或仪器。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了所述引物对或所述系统在下述a)、b)、c)或d)中的应用：a)大豆育种中的应用；b)预测或辅助预测大豆花粉粒育性；c)制备鉴定或辅助鉴定大豆花粉粒育性的产品；d)鉴定或辅助鉴定大豆花粉粒育性。实验证明，利用分子标记10-0871及其对应的引物对X1对大豆花粉粒育性的鉴定结果与利用常规检测方法的鉴定结果完全一致：将冀豆12(JD12)的带型命名为A，将雄性不育突变体(pst1)的带型命名为B，结果发现，F2中的58个花粉粒败育个体的带型均为B，20个花粉粒可育个体的电泳带型均为A，18个半不育个体的带型均相同，均为H带型，H带型为含有A带型和B带型的带型。表明，可利用分子标记10-0871与其对应的引物对X1对大豆花粉粒育性进行鉴定，也可用于对大豆雄性不育表型的分子标记辅助选择。附图说明图1为雄性不育突变体(pst1)和冀豆12的花粉粒育性的检测结果。其中A冀豆12(左)，B为雄性不育突变体(pst1，右)。图2为BSA法育性基因连锁标记筛选结果。其中，A为SSR-10-0810，B为SSR-10-0871，C为SSR-10-0753；1为可育池FJ，2为败育池SJ，3为突变体(pst1)。图3为育性基因连锁标记的验证结果。图4为分子标记10-0871对F2个体的基因型检测结果。pst1表示雄性不育突变体。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术做进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的雄性不育突变体(pst1)为大豆(Glycinemax(L.)Merr.)品种中品661的EMS诱变突变体，花粉粒高度败育，统一编号为ZDD25365，来源于中国国家种质资源库。公众也可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本专利技术的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的大豆(Glycinemax(L.)Merr.)品种冀豆12：记载于“陈强,闫龙,杨春燕，等.冀豆12遗传背景下3个回交组合高低蛋白含量后代品系SSR标记分析.中国农业科学,2014年02期”，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本专利技术的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的花粉粒育性的检测方法如下：取即将开放花蕾，剥出花药后用镊子夹裂，放在载玻片上并滴上10微升碘-碘化钾溶液(m/v,0.1％)，后放入光学显微镜下观察花粉粒染色效果。若花粉粒粒形状规则似球形，且呈深黑色则为可育；反之，花粉粒形状不规则，浅染或者不染色则为败育花粉粒。雄性不育突变体(pst1)和冀豆12的花粉粒育性的检测结果如图1所示。雄性不育突变体(pst1)的花粉粒全部败育，冀豆12的花粉粒全部可育。实施例1、大豆雄性不育位点的鉴定以冀豆12(JD12,♂)为父本、突变体(pst1,♀)为母本进行杂交，得到其子代F1，子代F1自交获得F2分离群体。根据F2个体花粉粒育性检测结果，选取10株可育(花粉粒败育率为0)个体混和提取DNA，构建可育池(FJ)，同时选取10株败育(花粉粒败育率为100％)个体混和提取DNA，构建败育池(SJ)。在均匀分布于全基因组的543对SSR中，两亲本间共检测到有多态性标记285对，用这些多态性标记引物对突变体(pst1)、可育池(FJ)及败育池(SJ)的基因组DNA分别进行PCR扩增，部分引物如表1所示，扩增产本文档来自技高网...

【技术保护点】
鉴定或辅助鉴定大豆花粉粒育性的方法，包括如下步骤：分别以待鉴定大豆、冀豆12和雄性不育突变体(pst1)的基因组DNA为模板，用名称为X1的PCR引物对进行PCR扩增，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所得到的PCR产物，按照下述方法确定所述待鉴定大豆的花粉粒育性：将冀豆12的PCR扩增产物的带型命名为A，将雄性不育突变体(pst1)的PCR扩增产物的带型命名为B，如果待鉴定大豆的PCR扩增产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的带型为所述A，所述待鉴定大豆为或候选为花粉粒可育大豆，如果待鉴定大豆的PCR扩增产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的带型为所述B，所述待鉴定大豆为或候选为花粉粒败育大豆，如果待鉴定大豆的PCR扩增产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的带型为H带型，所述H带型为含有所述A带型和所述B带型的带型，所述待鉴定大豆为或候选为花粉粒部分可育大豆；所述X1由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成。

【技术特征摘要】
1.鉴定或辅助鉴定大豆花粉粒育性的方法，包括如下步骤：分别以待鉴定大豆、冀豆12和雄性不育突变体(pst1)的基因组DNA为模板，用名称为X1的PCR引物对进行PCR扩增，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所得到的PCR产物，按照下述方法确定所述待鉴定大豆的花粉粒育性：将冀豆12的PCR扩增产物的带型命名为A，将雄性不育突变体(pst1)的PCR扩增产物的带型命名为B，如果待鉴定大豆的PCR扩增产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的带型为所述A，所述待鉴定大豆为或候选为花粉粒可育大豆，如果待鉴定大豆的PCR扩增产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的带型为所述B，所述待鉴定大豆为或候选为花粉粒败育大豆，如果待鉴定大豆的PCR扩增产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的带型为H带型，所述H带型为含有所述A带型和所述B带型的带型，所述待鉴定大豆为或候选为花粉粒部分可育大豆；所述X1由SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的两条单链DNA组成。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱丽娟，李忠峰，欧林，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11