假单胞菌中新型重组系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种假单胞菌中新型重组系统，该重组系统是根据来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)噬菌体Ab31与λRed类似的操纵子(Orf38，Orf37和Orf36)，和来自丁香假单胞菌B728a原噬菌体(Pseudomonas syringae pv.syringae B728a)与RecET类似的操纵子(recTE

A new recombinant system in Pseudomonas and its application

The invention discloses a novel recombinant Pseudomonas, the recombinant system is from Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa) operon Ab31 phage lambda Red and similar (Orf38, Orf37 and Orf36), and from Pseudomonas syringae B728a prophage (Pseudomonas syringae pv.syringae B728a operon) similar to the RecET (recTE

【技术实现步骤摘要】
假单胞菌中新型重组系统及其应用
本专利技术涉及一种革兰氏阴性杆菌中的重组系统及其构建与应用，尤其一种假单胞菌(铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、荧光假单胞菌或/和恶臭假单胞菌)中的重组系统及其构建与应用，属于微生物基因工程领域。
技术介绍
噬菌体编码的重组系统在修饰原核基因组和构建真核转基因物种时，能够有非常广泛的应用。它仅仅需要35个核苷酸作为同源臂，应用主要包括构建突变体-点突变、删除、插入和替换。较短的同源臂是这个技术的主要优势，这种技术被命名为重组工程。在大肠杆菌中，应用最广泛的重组系统是λRed系统和racRecET系统。λRed系统利用来自于λ噬菌体的Red操纵子(Redα，Redβ和Redγ)来介导线状和环状DNA分子进行同源重组。racRecET系统利用Rac前噬菌体的RecE和RecT蛋白在大肠杆菌中介导两个线状DNA分子发生同源重组。Redα和RecE是5’-3’双链DNA核酸外切酶，Redβ和RecT是单链退火蛋白。文献报道Redα/Redβ和RecE/RecT通过蛋白-蛋白相互作用来促进双链DNA的同源重组。Redγ可以抑制RecBCD的外切酶活性，RecBCD是一个多功能酶复合物，它能加工处理由双链断裂产生的DNA末端。Redγ可以形成一个二聚体的DNA类似物，与RecBCD系统中核酸外切酶和解旋酶相互并且抑制这些酶的活性。文献报道在RecE/RecT或者Redα/Redβ系统中加入Redγ可以提高DNA重组效率。来自发光杆菌(Photorhabdusluminescens)的Pluγ也可以模仿双螺旋DNA的形状和构造，抑制宿主体内核酸外切酶复合体Plu0632/Plu0630/Plu0633，从而在体内能够有效的提高同源重组的效率。类似λRed系统和racRecET系统的构建，在其它细菌的噬菌体或者原噬菌体基因组中搜寻并克隆含有核酸外切酶和单链退火蛋白的操纵子，在这个操纵子中插入能够提高重组效率的Redγ或者Pluγ蛋白基因，构建成一个完整的DNA重组系统，在大肠杆菌中构建完成后把这套重组系统通过电击转化或者接合转移导入操纵子来源的宿主进行遗传修饰。许多文献报道通过使用噬菌体重组功能操纵子构建的重组系统，例如发光杆菌、致病杆菌(Xenorhabdus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、梭菌(Clostridium)、丁香假单胞菌(P.syringae)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)等等，但是宿主专一性导致这些重组系统的应用范围很窄。假单胞菌是一种革兰氏阴性菌，需氧条件生长，属于假单胞菌科，研究最多的几种假单胞菌是人类条件致病菌铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，植物条件致病菌丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)，植物促生菌荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，还有在生物修复和生物防治过程中经常使用的恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)。传统的基因操作技术是通过限制性内切酶、DNA连接酶与PCR扩增等技术在体外实现目的基因的插入、敲除和点突变等修饰，但操作繁琐而且效率较低，由于限制性酶切位点的限制和操作繁琐和效率低下等缺点限制了对假单胞菌基因组的研究和改造。有关假单胞菌(铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌)中的重组系统及其构建与应用的研究及专利鲜见报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种假单胞菌(铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、荧光假单胞菌或/和恶臭假单胞菌)中的重组系统及其构建与应用。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案：本专利技术所述的假单胞菌中新型重组系统由一系列同源重组系统表达质粒构成，其特征在于：所述表达质粒在可诱导启动子下，表达一个操纵子，该操纵子除包含宿主特异性核酸外切酶以及单链DNA退火蛋白两个基因外，第三个基因是来源于大肠杆菌lambda噬菌体的Redγ，或是来源于发光杆菌(Photorhabdusluminescens)前噬菌体的Pluγ(Plu2934)，或是其它外源的核酸外切酶recBCD抑制蛋白；或者，该操纵子除包含宿主特异性核酸外切酶，单链DNA退火蛋白以及外源或内源核酸外切酶recBCD抑制蛋白三个基因外，第四个基因是来源于细菌染色体的单链DNA结合蛋白SSB，或是来源于细菌质粒上的SSB，或是来源于细菌噬菌体的SSB，或是来源于细菌前噬菌体的SSB。上述假单胞菌中新型重组系统中，进一步优化的技术方案是：所述重组系统中的系列同源重组系统表达质粒包括pBBR1复制起点、卡那霉素抗性基因和鼠李糖诱导型启动子的重组系统；其命名分别是pBBR1-Rha-red_gba-Kan，核苷酸序列如SEQIDNo.23所示；pBBR1-Rha-plu_gba-kan，核苷酸序列如SEQIDNo.24所示；pBBR1-Rha-TEpsy-kan，核苷酸序列如SEQIDNo.25所示；pBBR1-Rha-pluGam-TEpsy-kan，核苷酸序列如SEQIDNo.26所示；pBBR1-Rha-redGam-TEpsy-kan，核苷酸序列如SEQIDNo.27所示；pBBR1-Rha-BAS-kan，核苷酸序列如SEQIDNo.28所示；pBBR1-Rha-pluGam-BAS-kan，核苷酸序列如SEQIDNo.29所示；pBBR1-Rha-redGam-BAS-kan，核苷酸序列如SEQIDNo.30所示；其中，RecTEpsy是来源于丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)的前噬菌体中的RecTEpsy，B是单链DNA退火蛋白或称为重组酶，A是5’－3’双链DNA核酸外切酶，S是来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)噬菌体vB_PaeP_Tr60_Ab31的单链DNA结合蛋白(SSB)，Redγ是来源于lambda噬菌体的大肠杆菌核酸外切酶recBCD的抑制蛋白，Pluγ是来源于发光杆菌(Photorhabdusluminescens)前噬菌体的核酸外切酶recBCD的抑制蛋白。上述假单胞菌中新型重组系统中，最优化的技术方案是：所述重组系统中的系列同源重组系统表达质粒是：pBBR1-Rha-BAS-kan，pBBR1-Rha-pluGam-TEpsy-kan，pBBR1-Rha-redGam-TEpsy-kan，pBBR1-Rha-redGam-BAS-kan或pBBR1-Rha-pluGam-BAS-kan。上述假单胞菌中新型重组系统中，所述假单胞菌优选是铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、荧光假单胞菌或/和恶臭假单胞菌。本专利技术所述假单胞菌中新型重组系统在假单胞菌属不同种中介导短同源臂和长同源臂之间的同源重组进行基因组DNA或质粒遗传修饰中的应用。其中，所述短同源臂是指50bp-150bp的同源臂，所述长同源臂是指大于150bp的同源臂。各种菌株中最佳的重组系统是不同的，最佳的重组条件也不相同，进行条件优化例如感受态细胞制备方法优化，DNA转化量优化，抗生素选择浓度优化，同源臂长度优化等可以提高重组效率，进一步利用不同菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种假单胞菌中新型重组系统，该重组系统由一系列同源重组系统表达质粒构成，其特征在于：所述表达质粒在可诱导启动子下，表达一个操纵子，该操纵子除包含宿主特异性核酸外切酶以及单链DNA退火蛋白两个基因外，第三个基因是来源于大肠杆菌lambda噬菌体的Redγ，或是来源于发光杆菌(Photorhabdus luminescens)前噬菌体的Pluγ(Plu2934)，或是其它外源的核酸外切酶recBCD抑制蛋白；或者，该操纵子除包含宿主特异性核酸外切酶，单链DNA退火蛋白以及外源或内源核酸外切酶recBCD抑制蛋白三个基因外，第四个基因是来源于细菌染色体的单链DNA结合蛋白SSB，或是来源于细菌质粒上的SSB，或是来源于细菌噬菌体的SSB，或是来源于细菌前噬菌体的SSB。

【技术特征摘要】
1.一种假单胞菌中新型重组系统，该重组系统由一系列同源重组系统表达质粒构成，其特征在于：所述表达质粒在可诱导启动子下，表达一个操纵子，该操纵子除包含宿主特异性核酸外切酶以及单链DNA退火蛋白两个基因外，第三个基因是来源于大肠杆菌lambda噬菌体的Redγ，或是来源于发光杆菌(Photorhabdusluminescens)前噬菌体的Pluγ(Plu2934)，或是其它外源的核酸外切酶recBCD抑制蛋白；或者，该操纵子除包含宿主特异性核酸外切酶，单链DNA退火蛋白以及外源或内源核酸外切酶recBCD抑制蛋白三个基因外，第四个基因是来源于细菌染色体的单链DNA结合蛋白SSB，或是来源于细菌质粒上的SSB，或是来源于细菌噬菌体的SSB，或是来源于细菌前噬菌体的SSB。2.根据权利要求1所述假单胞菌中新型重组系统，其特征在于：所述重组系统中的系列同源重组系统表达质粒包括pBBR1复制起点、卡那霉素抗性基因和鼠李糖诱导型启动子的重组系统；其命名分别是pBBR1-Rha-red_gba-kan，核苷酸序列如SEQIDNo.23所示；pBBR1-Rha-plu_gba-kan，核苷酸序列如SEQIDNo.24所示；pBBR1-Rha-TEpsy-kan，核苷酸序列如SEQIDNo.25所示；pBBR1-Rha-pluGam-TEpsy-kan，核苷酸序列如SEQIDNo.26所示；pBBR1-Rha-redGam-TEpsy-kan，核苷酸序列如SEQIDNo.27所示；pBBR1-Rha-BAS-kan，核苷酸序列如SEQIDNo.28所示；pBBR1-Rha-pluGam-BAS-kan，核苷酸序列如SEQIDNo.29所示；pBBR1-Rha-redGam-BAS-kan，核苷酸序列如SEQIDNo.30所示；其中，RecTEpsy是来源于丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)的前噬菌体中的RecTEpsy，B是单链DNA退火蛋白或称为重组酶，A是5’－3’双链DNA核酸外切酶，S是来源于...

【专利技术属性】
技术研发人员：张友明，尹佳，符军，郑文韬，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37