一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法，属于微生物技术领域。该发酵制备得到葡萄糖氧化酶具有高的耐热性和耐酸性，解决了在食品及饲料中因高温及酸性环境中使用导致的酶活力低的缺陷。具体步骤如下：将菌种培养成孢子并将孢子清洗后制备单孢子菌悬液；将单孢子菌悬液接入种子培养基中发酵培养；将种子培养液接入摇瓶发酵培养基中发酵培养，将发酵补充营养液加入发酵液中；糊精、可溶性淀粉及山梨酸钾加入发酵液中并搅拌均匀，将发酵液冷冻，干燥并粉碎，得葡萄糖氧化酶。发酵得到的葡萄糖氧化酶粗酶液经过热处理、硫酸铵‑乙醇复合沉淀及离子交换层析和分子筛凝胶过滤层析，得到高回收率高纯度的葡萄糖氧化酶。

Fermentation, preparation and separation and purification method of heat resisting acid resisting glucose oxidase

The invention discloses a method for fermenting, preparing, separating and purifying a heat resisting acid resisting glucose oxidase, belonging to the field of microbial technology. The glucose oxidase prepared by the fermentation has the advantages of high heat resistance and acid resistance, and solves the defects of low enzyme activity caused by the use of high temperature and acid environment in food and feed. The specific steps are as follows: bacteria into spores and spores after cleaning the preparation of single spore suspension; single spore suspension access seed culture fermentation medium; seed culture medium will shake flask fermentation broth fermentation access, nutritional supplement was added in the fermentation liquid of dextrin and soluble starch; and adding potassium sorbate in fermentation broth and stir evenly, the fermentation liquid is frozen, dried and crushed to glucose oxidase. The fermentation of glucose oxidase enzyme after heat treatment, ammonium sulfate precipitation and ethanol composite ion-exchange chromatography and gel filtration chromatography, glucose oxidase obtained high purity and high recovery rate.

【技术实现步骤摘要】
一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法
本专利技术涉及微生物
，尤其涉及一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法。
技术介绍
葡萄糖氧化酶是酶
中一种非常重要的酶，它能利用分子氧作为电子受体，专一催化β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢。由于其与生命重要物质葡萄糖和氧的密切关系，导致了它在科研、医药和食品工业生产上广泛的应用。在食品工业中，葡萄糖氧化酶可用于除去食品或药品中的葡萄糖，从而防止食品发生褐变或获得纯度较高的低聚糖；同时，葡萄糖氧化酶凭其天然的优良特性,可作为一个较为理想的溴酸钾取代物，用作一种更为安全的面粉改良剂；在发酵工业中，葡萄糖氧化酶的催化产物-葡萄糖酸，可用于生产葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌等；在医学诊断方面，鉴于葡萄糖氧化酶作用的高度专一性,也被用于一些复杂生化体系中葡萄糖的定量测定,如快速检测血糖、尿糖。国家知识产权局于2014年8月6日公布的一篇专利申请号为201410228211.0，名称：葡萄糖氧化酶制剂的制备方法及其利用，此专利提出如下技术方案：将特异青霉接种于含有碳源、氮源、无机盐液及微量元素的发酵培养基的发酵罐进行通气发酵制成发酵液，发酵液经固液分离制成葡萄糖氧化酶制剂，该菌种制备的葡萄糖氧化酶存在如下的技术问题：其一，该菌种发酵培养产生的葡萄糖氧化酶的热稳定性差，并且在酸性环境下很容易失活，不具有耐酸性；其二，该菌种发酵培养产生的葡萄糖氧化酶的酶活力低，且生产效率低下；这俩个问题大大限制了该菌种制备的葡萄糖氧化酶的使用范围，因此，该制备方法制备的葡萄糖氧化酶难以在市场上推广和使用。目前国内外己有许多葡萄糖氧化酶的相关研究报道，其中大部分来源于微生物，微生物中一般对中温菌的产酶研究较多，而对嗜热真菌产耐热葡萄糖氧化酶的研究相对较少。因此，研究嗜热拟青霉产耐热性的葡萄糖氧化酶具有重大的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种热稳定性高、耐酸性好的且酶活力高的葡萄糖氧化酶酶制剂的发酵制备方法及分离纯化方法，本专利技术通过分段培养及中间补料技术提高葡萄糖氧化酶的产量，并进一步从发酵液中分离纯化到高纯度的葡萄糖氧化酶。该发酵制备的葡萄糖氧化酶耐热性高、耐酸性好，非常适合在食品及饲料中适用。为了解决上述技术问题,本专利技术提供了一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，具体步骤如下：(1)将嗜热拟青霉菌种在PDA活化培养基平板上划线活化，并将PDA活化培养基平板置于30～40℃的恒温培养箱中活化培养48～72h，即得嗜热拟青霉丝；(2)用接种环刮取步骤(1)中所制备的嗜热拟青霉丝接种于斜面培养基上，并将斜面培养基置于30～40℃的条件下培养2～4d，即得孢子；(3)将步骤(2)中所制备的孢子用含有0.01％(v/v)吐温80的0.75％无菌生理盐水清洗孢子，将清洗后的孢子放入盛有50～55mL无菌生理盐水和无菌玻璃珠的锥形瓶中并充分振荡30～45min，待孢子充分分散后，制备孢子含量为1.0×108CFU/mL的孢子悬液，即得单孢子菌悬液；(4)将步骤(3)中所制备的单孢子菌悬液以4～8％(v/v)的接种量接入装有30～50mL种子培养基的三角瓶中，三角瓶在转速为160～200r/min、温度为30～45的条件下，摇床培养18～24h，即得嗜热拟青霉种子培养液；(5)将步骤(4)中所制备的嗜热拟青霉种子培养液以6～10％(v/v)的接种量接入装有150～200mL摇瓶发酵培养基的三角瓶中，三角瓶采用6层纱布封口，将封口的三角瓶在转速为160～200r/min、温度为40～45℃的条件下摇床发酵30～48h，即得嗜热拟青霉发酵培养液；(6)将60～100mL的发酵补充营养液加入步骤(5)中所制备的嗜热拟青霉发酵培养液中，即得发酵液一，待发酵液一温度降至37～40℃时，调节发酵液一的pH为5～6，并继续振动发酵，待发酵时间达72h时、温度降至28～32℃，再次向发酵液一中加入50～80mL的发酵补充营养液，并继续发酵24～48h，即得发酵液二；(7)将步骤(6)中所制备的发酵液二经4层纱布过滤，得菌丝和滤液，将滤液在转速为8000r/min的条件下离心20～30min，得沉淀和上清液，将上清液用超滤膜超滤2次，即得截留液，将所得截留液浓缩3～4倍，即得浓缩液，将所得浓缩液在60～70℃条件下旋转蒸发仪抽真空浓缩，即得粗酶液；(8)将1～2wt％的糊精、2～4wt％的可溶性淀粉和0.1～0.2wt％的山梨酸钾加入步骤(7)中所制备的粗酶液中，并搅拌均匀，即得葡萄糖氧化酶溶液，将葡萄糖氧化酶溶液置于-20℃冷冻6～8h，将冷冻后的葡萄糖氧化酶溶液置于真空度35～45Pa、温度为-35℃的条件下，冷冻干燥15～20h并粉碎，即得葡萄糖氧化酶酶制剂。进一步地，所述步骤(1)中PDA活化培养基的成分及配比为土豆浸出液100mL、无机盐液1mL、蔗糖2g及琼脂粉1.5g。进一步地，所述土豆浸出液的制备方法如下：将土豆削皮切成1cm3小块，称取200g土豆小块放入容器中，向容器中加1000mL水煮沸30min并过滤，得土豆滤液，将土豆滤液定容到1000mL，即得土豆浸出液。进一步地，所述步骤(2)中斜面培养基为嗜热拟青霉孢子培养基。进一步地，所述嗜热拟青霉孢子培养基的成分及配比为土豆浸出液50mL、麸皮浸出液50mL、蔗糖1g及琼脂粉1.5g。进一步地，所述麸皮浸出液的制备方法如下：称取50g麸皮置于容器中，向容器中加入300mL水煮沸30min并过滤，得麸皮滤液，将麸皮滤液定容到200mL，即得麸皮浸出液。进一步地，所述步骤(5)中的摇瓶发酵培养基的成分及配比为PDA浸出液100mL、麸皮浸出液100mL、蔗糖15～20g、豆粕粉10～15g、谷朊粉10～20g、玉米粉5～10g、蛋白胨5～10g、硫酸铵0.5g、硝酸铵2～5g、尿素2～5g、玉米浆20～30mL、吐温802～5mL及复合微量元素1～5mL，并加去离子水至1000mL；所述复合微量元素的成分为MnCl2·4H2O0.1g、CoCl20.05g、CuSO40.02g、MgSO40.3g、K2PO41g、FeSO4·7H2O0.1g、ZnCl20.03g、LiCl0.05g、CaCl20.05g、H3BO30.01g及KI0.5g，并加去离子水1000mL。进一步地，所述步骤(6)中发酵补充营养液的成分及配比为蔗糖20～50g、豆饼粉20～50g、尿素5g、NH4NO35g、补充去离子水至1000mL。进一步地，所述步骤(7)中第一次采用截留分子质量为100～120kDa的超滤膜；第二次采用截留分子质量为20～30kDa的超滤膜。本专利技术还提供了一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的分离纯化方法，具体步骤如下：(1)将嗜热拟青霉发酵培养液在8000r/min的条件下，离心20～30min，弃沉淀保留上清液，将上清液加热至80℃，保温20～30min，待上清液冷却至室温后放置4℃的条件下静置6～8h，将静置后的上清液置于8000r/min的条件下，离心20～30min，去掉沉淀下的杂蛋白；(2)向热处理后的葡萄糖氧化酶粗酶液中加入硫酸铵，至饱和度达到30～40％，并调节其pH为6.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)将嗜热拟青霉菌种在PDA活化培养基平板上划线活化，并将PDA活化培养基平板置于30～40℃的恒温培养箱中活化培养48～72h，即得嗜热拟青霉丝；(2)用接种环刮取步骤(1)中所制备的嗜热拟青霉丝接种于斜面培养基上，并将斜面培养基置于30～40℃的条件下培养2～4d，即得孢子；(3)将步骤(2)中所制备的孢子用含有0.01％(v/v)吐温80的0.75％无菌生理盐水清洗孢子，将清洗后的孢子放入盛有50～55mL无菌生理盐水和无菌玻璃珠的锥形瓶中并充分振荡30～45min，待孢子充分分散后，制备孢子含量为1.0×10

【技术特征摘要】
1.一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)将嗜热拟青霉菌种在PDA活化培养基平板上划线活化，并将PDA活化培养基平板置于30～40℃的恒温培养箱中活化培养48～72h，即得嗜热拟青霉丝；(2)用接种环刮取步骤(1)中所制备的嗜热拟青霉丝接种于斜面培养基上，并将斜面培养基置于30～40℃的条件下培养2～4d，即得孢子；(3)将步骤(2)中所制备的孢子用含有0.01％(v/v)吐温80的0.75％无菌生理盐水清洗孢子，将清洗后的孢子放入盛有50～55mL无菌生理盐水和无菌玻璃珠的锥形瓶中并充分振荡30～45min，待孢子充分分散后，制备孢子含量为1.0×108CFU/mL的孢子悬液，即得单孢子菌悬液；(4)将步骤(3)中所制备的单孢子菌悬液以4～8％(v/v)的接种量接入装有30～50mL种子培养基的三角瓶中，三角瓶在转速为160～200r/min、温度为30～45的条件下，摇床培养18～24h，即得嗜热拟青霉种子培养液；(5)将步骤(4)中所制备的嗜热拟青霉种子培养液以6～10％(v/v)的接种量接入装有150～200mL摇瓶发酵培养基的三角瓶中，三角瓶采用6层纱布封口，将封口的三角瓶在转速为160～200r/min、温度为40～45℃的条件下摇床发酵30～48h，即得嗜热拟青霉发酵培养液；(6)将60～100mL的发酵补充营养液加入步骤(5)中所制备的嗜热拟青霉发酵培养液中，即得发酵液一，待发酵液一温度降至37～40℃时，调节发酵液一的pH为5～6，并继续振动发酵，待发酵时间达72h时、温度降至28～32℃，再次向发酵液一中加入50～80mL的发酵补充营养液，并继续发酵24～48h，即得发酵液二；(7)将步骤(6)中所制备的发酵液二经4层纱布过滤，得菌丝和滤液，将滤液在转速为8000r/min的条件下离心20～30min，得沉淀和上清液，将上清液用超滤膜超滤2次，即得截留液，将所得截留液浓缩3～4倍，即得浓缩液，将所得浓缩液在60～70℃条件下旋转蒸发仪抽真空浓缩，即得粗酶液；(8)将1～2wt％的糊精、2～4wt％的可溶性淀粉和0.1～0.2wt％的山梨酸钾加入步骤(7)中所制备的粗酶液中，并搅拌均匀，即得葡萄糖氧化酶溶液，将葡萄糖氧化酶溶液置于-20℃冷冻6～8h，将冷冻后的葡萄糖氧化酶溶液置于真空度35～45Pa、温度为-35℃的条件下，冷冻干燥15～20h并粉碎，即得葡萄糖氧化酶酶制剂。2.根据权利要求1所述的一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中PDA活化培养基的成分及配比为土豆浸出液100mL、无机盐液1mL、蔗糖2g及琼脂粉1.5g。3.根据权利要求2所述的一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，其特征在于，所述土豆浸出液的制备方法如下：将土豆削皮切成1cm3小块，称取200g土豆小块放入容器中，向容器中加1000mL水煮沸30min并过滤，得土豆滤液，将土豆滤液定容到1000mL，即得土豆浸出液。4.根据权利要求1所述的一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中斜面培养基为嗜热拟青霉孢子培养基。5.根据权利要求4所述的一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：高兆建，张铁柱，孙会刚，李同祥，刘恩岐，曹建冬，顾强，沈彬彬，
申请(专利权)人：徐州工程学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32