定点突变的流感病毒、其活疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及经过定点突变的流感病毒、多个位点同时突变的流感病毒，所述流感病毒可以是人源的，也可以是其它动物的。本发明专利技术还涉及定点突变流感病毒的方法，所述方法包括使用反向遗传技术在流感病毒基因组中引入UAG、使用基因密码子扩展技术将非天然氨基酸定点引入流感病毒基因中。本发明专利技术进一步涉及定点突变或多个突变位点组合的流感病毒的应用，如作为减毒活疫苗、复制可控的安全流感病毒模型等的用途。

Influenza virus of fixed point mutation, live vaccine thereof, preparation method and application thereof

The present invention relates to influenza viruses that are mutated by site directed mutagenesis of influenza viruses and multiple loci simultaneously, which can be human or other animals. The invention also relates to a method for influenza virus mutation, which comprises the use of reverse genetics technology into the UAG, in the influenza virus genome using gene codon extension technology of non natural amino acids into the influenza virus gene in point. The invention further relates to the application of influenza viruses with site directed mutagenesis or multiple mutation sites, such as the use of attenuated live vaccines and the replication of a controlled influenza virus model.

【技术实现步骤摘要】
定点突变的流感病毒、其活疫苗及其制备方法和应用
本专利技术属于生物制药领域，具体涉及定点突变、定点修饰、复制可控的流感病毒活疫苗，所述的定点突变为用非天然氨基酸定点突变流感病毒任意蛋白的天然氨基酸，还涉及将经过所述定点突变的位点进行组合制备在多个基因片段上引入非天然氨基酸的流感病毒。本专利技术还涉及定点突变流感病毒的方法，所述方法包括使用基因密码子扩展技术和基因密码子拓展技术将非天然氨基酸定点引入流感病毒的任意基因中。本专利技术进一步涉及定点突变或多点组合的流感病毒的应用，如作为流感病毒活疫苗、流感病毒强毒的安全模型等的用途。
技术介绍
流感是由流感病毒所引起的一种急性呼吸道传播疾病，可季节性地感染禽类、哺乳动物和人类。流感病毒又可分为A、B、C三种类型，其中以A型(又称甲型)流感病毒的暴发最为频繁。甲型流感病毒属于正黏病毒科，其基因组共由8个独立的单链RNA片段组成，编码10种蛋白：血凝素蛋白(HA)；基质蛋白(M)分为M1和M2；神经氨酸酶(NA)；核壳蛋白(NP)；非结构蛋白(NS)包括NS1和NEP；PB1，PB2和PA三种聚合酶，每种蛋白对于流感病毒都具有重要的生物学功能。甲型流感病毒根据其主要表面抗原HA和NA的抗原性的差异分为不同亚型，目前已发现了18种亚型的HA蛋白和11种亚型的NA蛋白。A型流感病毒大规模流行可引起极高的发病率和死亡率，严重威胁着人类的健康(W.H.O.2003；Coleman2007)。A型流感病毒在二十世纪主要引起了三次大型流感，即1918年的H1N1，1957年的H2N2以及1968年的H3N2，共造成约5000万人死亡(Kilbourne2006；Taubenberger,Hultinetal.2007)。2009年甲型流感也是由H1N1流感病毒引起(Dawood,Jainetal.2009；ZimmerandBurke2009)，其传播之迅速，引起了世界的关注。据统计，全世界平均每年有30-50万人死于流感(Fiore,Shayetal.2007)。自流感发现以来，科学家们一直致力于对于流感病毒的防控，接种疫苗目前是最有利于预防流感，控制流感传播的手段。20世纪30年代末流感病毒疫苗开始在人类中使用，目前的流感病毒疫苗分为以下几种：灭活病毒疫苗和减毒病毒疫苗，DNA疫苗，亚单位疫苗，重组病毒载体疫苗，类病毒颗粒疫苗。目前应用的灭活流感疫苗为三价疫苗,包括H1N1、H3N2和B型流感病毒疫苗,多年的临床应用表明流感灭活疫苗具有很好的免疫效果和安全性,接种后可刺激机体产生相应的抗体，但缺点是不能刺激产生分泌型免疫球蛋白(sIgA)。另外,流感病毒在鸡胚上传代会发生抗原变异,且大部分鸡体内携带有多种病毒,疫苗有被这些病毒污染的可能。由于新流行的抗原变异株必须要能在鸡胚中高效复制,才有可能生产大量疫苗。随着制备疫苗所用的野生型病毒在鸡蛋中生长,其免疫原性在一定程度上被改变或降低。如果生产的疫苗株与当前流行株不匹配,就会失去免疫保护效果。近年来,一个重大进展就是利用哺乳动物细胞代替鸡胚培养,哺乳动物细胞主要是MDCK细胞和Vero细胞,具有无外源因子污染、易于规模化生产、抗原稳定等优点,哺乳动物细胞培养的流感疫苗具有较好的免疫原性,接种后不良反应轻,较安全。研究阶段取得了很好的实验结果。但还有一些问题未能解决,临床尚未见到使用。减毒活疫苗主要包括温度敏感型疫苗、重配疫苗、冷适应减毒流感活疫苗、反向遗传技术疫苗和复制缺陷流感疫苗5种类型。现在研制成功的是冷适应减毒流感活疫苗。该疫苗是一种降低了毒力并能在最佳适应温度下生长的流感病毒株。这种病毒只能在25℃左右复制,不能在37℃下传代,因此其感染只局限于上呼吸道，临床上无明显的流感症状。利用弱毒株与当前的流行毒株进行基因重组,得到带有弱毒株片段和流行株的HA和NA基因的重组病毒。多项研究证实,冷适应毒株生物学性质有很好的稳定性。弱毒流感疫苗与灭活疫苗的免疫后抗体阳转率都在50％～70％,能有效控制流感的流行。冷适应减毒活疫苗已在俄罗斯使用,美国也将被批准使用。其在接种途径、免疫效果方面比灭活疫苗有一定的优势,如可通过鼻内喷雾或者点滴方式来免疫。冷适应减毒活疫苗在上呼吸道复制,可诱导黏膜的sIgA和全身的体液及细胞免疫反应,产生比灭活疫苗更广泛更持久的保护。但冷适应减毒活疫苗可与其他流感病毒发生基因重配后得到有毒的重配株病毒,并且在二价或三价冷适应减毒活疫苗中可能会出现干扰现象。理想的疫苗应具备下列条件:①免疫原性强.②毒性反应小.③遗传学上稳定.④在流行期能快速获得与流行株一致的抗原性。鉴于活疫苗相对于灭活疫苗的优势及活疫苗的安全考虑，使用哺乳动物细胞生产复制可控、遗传稳定、安全有效的新型流感病毒活疫苗，提高疫苗的安全性和有效性，将会促进流感疫苗快速发展。遗传密码扩展技术经过数年的研究，人们对原核生物核糖体的翻译机制已有较全面的理解，多种核糖体不同功能状态的晶体和电镜结构已得到解析，大多数氨tRNA合成酶的结构也已获得。基于这些研究成果，近年来发展起来了遗传密码扩展的技术—利用琥珀终止密码子(TAG)来编码多种非天然氨基酸并在生物活体内将其定点插入。到目前为止，这一技术已经将数种非天然氨基酸成功地定点表达在活细胞的蛋白质当中，赋予了这些蛋白质新颖的物理、化学和生理性质。使用这一方法，可以将非天然氨基酸(包括亲和标记和光致异构化的氨基酸、羰基氨基酸和糖基化氨基酸)引入蛋白质中(L.Wang等人，(2001)，SCIENCE292:498-500；J.W.Chin等，2002，JournaloftheAmericanChemicalSociety124:9026-9027；J.W.Chin,&P.G.Schultz,2002,ChemBioChem11:1135-1137)。这些研究表明，有可能且有选择性且常规地引入化学官能基团到蛋白质中，例如，羰基、炔基、和叠氮基团等特殊化学基团，这些基团一般能够有效且选择性地形成稳定的共价键，更加有利于蛋白质的定点特异修饰，改善蛋白质的性质。这一技术不仅可以用于蛋白质的定点修饰上，还被用在了活体生物体(如病毒、细菌等)的定点标记、定点修饰、复制的控制等方面。这种在基因组中引入TAG的生物活体的复制、蛋白表达依赖于外源非天然氨基酸生物正交系统。
技术实现思路
专利技术人经过对现有技术的思考和研究，将琥珀终止密码子(TAG)引入到流感病毒的基因组中，并利用古甲烷球菌的tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(tRNAPyl)的蛋白质翻译系统使非天然氨基酸定点掺入到相应的蛋白的相应位点上，从而得到了定点突变的流感病毒。这类流感病毒的复制、蛋白表达等一系列的生命过程依赖于非天然氨基酸生物正交系统，即该类病毒可以在非天然氨基酸生物正交系统中进行包装、繁殖、制备，而一旦脱离了该非天然氨基酸生物正交系统，病毒就不能进行复制、蛋白表达等生命活动。因此，利用对非天然氨基酸依赖性制备的流感病毒，具有很高的安全性。此外，该定点突变的流感病毒可以进一步修饰，进而得到定点修饰的流感病毒，所述的定点修饰例如将一些免疫增强剂定点到流感病毒蛋白的特定的氨基酸进行的方法，从而得到性能改善的流感病毒，如得到免本文档来自技高网...

【技术保护点】
定点突变的流感病毒，其特征在于将选自流感病毒的PA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NS或M中的至少一个蛋白的至少一个位点的氨基酸突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸选自：

【技术特征摘要】
1.定点突变的流感病毒，其特征在于将选自流感病毒的PA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NS或M中的至少一个蛋白的至少一个位点的氨基酸突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸选自：所示的Lys-diazirine，所示的Lys-azido，或其它含有双吖丙啶、叠氮结构的非天然氨基酸中的至少1种。2.如权利要求1所述的定点突变的流感病毒，其中所述的非天然氨基酸是位于第N位的Lys-diazirine，其在流感病毒蛋白中的连接方式如下式所示：其中，由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，第N位可以是流感病毒的PA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NS或M中的任意一位，相应地，R1为第1至第N-1位氨基酸残基，R2为第N+1位至C末端的氨基酸残基，R3为3.如权利要求1所述的定点突变的流感病毒，其中所述的非天然氨基酸是位于第N位的Lys-azido，其在流感病毒蛋白中的连接方式如下式所示：其中，由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，第N位可以是流感病毒的PA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NS或M中的任意一位，相应地，R1为第1至第N-1位氨基酸残基，R2为第N+1位至C末端的氨基酸残基，R4为4.权利要求1－3中任一项的定点突变的流感病毒，其经过修饰，或者包含数个突变位点的组合。5.如权利要求4所述的定点突变的流感病毒，其是将PA上的R266、PB1上的R52、PB2上的K33、NP上的D101四个位点进行了组合突变。6.如权利要求1-5中任一项所述的突变的流感病毒，其特征在于，未经突变的PB2的氨基酸序列与SEQIDNO:2所示的核酸编码的氨基酸序列相同，未经突变的PB1的氨基酸序列与SEQIDNO:3所示的核酸编码的氨基酸序列相同，未经突变的PA的氨基酸序列与SEQIDNO:4所示的核酸编码的氨基酸序列相同，未经突变的HA的氨基酸序列与SEQIDNO:5所示的核酸编码的氨基酸序列相同，未经突变的NP的氨基酸序列与SEQIDNO:6所示的核酸编码的氨基酸序列相同，未经突变的NA的氨基酸序列与SEQIDNO:7所示的核酸编码的氨基酸序列相同，未经突变的M的氨基酸序列与SEQIDNO:8所示的核酸编码的氨基酸序列相同，或未经突变的NS的氨基酸序列与SEQIDNO:9所示的核酸编码的氨基酸序列相同。7.根据权利要求5所述的定点突变的流感病毒，其是WSN-RNP-TAG。8.一种编码如权利要求1-7中任一项所述的突变的流感病毒或其经突变的蛋白的核酸分子，其特征在于在终止密码子之外，还包含密码子UAG。9.核酸载体，其可拯救权利要求1-7中任一项所述的突变型流感病毒。10.制备权利要求1-7中任一项所述的定点突变病毒的方法，包括步骤：(1)选择步骤：在病毒不同蛋白中选择期望突变的一个或多个特定氨基酸位点；(2)基因突变：将编码对应于(1)中选择的位点的病毒蛋白的氨基酸的密码子用基因工程方法突变为密码子TAG；(3)表达载体构建：将(2)得到的突变的病毒蛋白的编码核酸与合适的载体可操作地连接，得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：周德敏，司龙龙，周雪莹，张子威，徐欢，田振宇，姚天卓，肖苏龙，张传领，夏青，张礼和，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11