一种铜绿假单胞菌噬菌体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种铜绿假单胞菌噬菌体，该铜绿假单胞菌噬菌体，菌株名为vB_PaeM_QKL1，保藏号CGMCC No.13381，分类命名为铜绿假单胞菌噬菌体，于2016年12月08日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，简称CGMCC。本发明专利技术还提供了上述铜绿假单胞菌噬菌体的应用。本发明专利技术铜绿假单胞菌噬菌体尾刺中有胞外聚合物的降解酶类，能裂解细胞被膜进而裂解生物被膜产生菌，从而彻底去除细菌生物被膜；本发明专利技术铜绿假单胞菌噬菌体对铜绿假单胞菌生物被膜的抑制效果明显，能够破坏铜绿假单胞菌生物被膜，还可与抗生素、常用化学清洁剂联合应用。

Pseudomonas aeruginosa bacteriophage and application thereof

The invention provides a Pseudomonas aeruginosa phage, the Pseudomonas aeruginosa phage strains, named vB_PaeM_QKL1, No.13381 accession No. CGMCC classification, named as Pseudomonas aeruginosa, on 08 December 2016 is preserved in the \Chinese microbial culture collection Commission General Microbiology center\, referred to as CGMCC. The present invention also provides the use of the Pseudomonas aeruginosa bacteriophages. The invention of Pseudomonas aeruginosa phage tail in degradation of extracellular polymeric enzymes, cell lysis and membrane lysis to biofilm producing strains, so as to completely remove the bacterial biofilm; the invention of Pseudomonas aeruginosa phage of Pseudomonas Areuginosa inhibitory effect of membrane obviously, can destroy the Pseudomonas aeruginosa biofilm, also could be used in combination with antibiotics, chemical cleaning agent.

【技术实现步骤摘要】
一种铜绿假单胞菌噬菌体及其应用
本专利技术属于生物
，更具体地说，涉及一种铜绿假单胞菌噬菌体及其应用。
技术介绍
铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)也称绿脓杆菌是一种在环境中广泛存在的革兰氏阴性致病菌，能够引起人的囊肿性纤维症、以及严重烧伤和某些癌症患者危及生命的急性感染和免疫抑制患者的慢性感染。在动物，铜绿假单胞菌主要引起马的子宫内膜炎，牛和其他反刍动物的乳腺炎，毛丝鼠的中耳炎、内耳炎，水貂的出血性肺炎等，给养殖业带来了巨大的损失。治疗铜绿假单胞菌感染的传统的方法是抗生素，然而由于多重耐药铜绿假单胞菌菌株的出现和新的治疗制剂的短缺，使得该菌引起感染的治疗变得越来越困难。铜绿假单胞菌的耐药机制很多，而生物被膜(Biofilm，BF)的形成是一个很重要的耐药机制，也是引起临床治疗失败的很重要原因。细菌生物膜是细菌在生长过程中为适应生存环境而吸附于机体或物体表面形成的一种与浮游细菌相对应的生长方式，由细菌和它所分泌的细胞外基质组成，主要组成分为胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)。BF细菌有极强的耐药性，且BF可以保护细菌逃避机体的免疫作用，导致病原菌难以彻底清除。现已证实约有90％的微生物生活在微生物被膜(bacterialbiofilm，BF)系统中，80％的细菌性疾病与细菌生物膜有关。近年来,临床上细菌生物膜引起的顽固性感染日益增多，给临床治疗增加难度。目前国际上对绿脓杆菌BF抑制作用主要致力于抗生素的研究，目前已发现十四、十五元环大环内酯类抗生素(如红霉素、克拉霉素、阿奇霉素)、利福平等在体外能抑制绿脓杆菌形成BF，但效果一般。噬菌体作为特异性感染和裂解细菌的病毒，在20年代早期，噬菌体疗法已被认为是一种用于细菌感染性疾病治疗的有效药物。近年来，全世界范围内持续增加出现的耐药性菌株，噬菌体疗法可能会是常规抗生素治疗的替代方法之一，许多实验表明噬菌体疗法是有效的，并且在某种程度上，噬菌体疗法优于抗生素治疗方法：第一，噬菌体更具有特异性；第二，噬菌体可以在感染部位复制和大量聚集，从而提高了杀菌效率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型铜绿假单胞菌噬菌体及其制剂，用于铜绿假单胞菌生物被膜抑制，高效降解铜绿假单胞菌生物被膜。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种铜绿假单胞菌噬菌体，该铜绿假单胞菌噬菌体菌株名为vB_PaeM_QKL1，保藏号CGMCCNo.13381，分类命名为铜绿假单胞菌噬菌体，于2016年12月08日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。本专利技术提供的铜绿假单胞菌噬菌体以水貂来源的铜绿假单胞菌为宿主，分离得到铜绿假单胞菌强裂解性噬菌体，通过一步生长曲线表征，其潜伏期、裂解期分别约为20min、35min，裂解量为120PFU/感染细胞，裂解能力较强。本专利技术噬菌体属于肌尾病毒科(Myoviridae)，头部为二十面体，直径约为50nm，尾长约为65nm。本专利技术还提供了上述铜绿假单胞菌噬菌体的应用，用于降解铜绿假单胞菌生物被膜。优选方式下，所述铜绿假单胞菌噬菌体用于以下方面：(1)制备抑制铜绿假单胞菌生物被膜形成的产品；(2)制备裂解铜绿假单胞菌生物被膜的产品；(3)制备降低铜绿假单胞菌生物被膜形成总量的产品；(4)制备与抗生素共同作用提高对铜绿假单胞菌的杀伤效率的产品；(5)制备用与化学清洁剂联合应用的消毒的产品。优选方式下，上述铜绿假单胞菌噬菌体的应用还包括制备含有铜绿假单胞菌噬菌体的制剂，所述制剂活性成分包括铜绿假单胞菌噬菌体CGMCCNo.13381。进一步优化，所述含有铜绿假单胞菌噬菌体的制剂应用于以下方面：(1)制备抑制铜绿假单胞菌生物被膜形成的产品；(2)制备裂解铜绿假单胞菌生物被膜的产品；(3)制备降低铜绿假单胞菌生物被膜形成总量的产品；(4)制备与抗生素共同作用提高对铜绿假单胞菌的杀伤效率的产品；(5)制备用与化学清洁剂联合应用的消毒的产品。本专利技术相对于现有技术具有如下优势：1、本专利技术铜绿假单胞菌噬菌体尾刺(tailspike)中有胞外聚合物(EPS)的降解酶类，这些酶类具有裂解细胞被膜进而裂解生物被膜产生菌的潜力，从而彻底去除细菌生物被膜。2、本专利技术铜绿假单胞菌噬菌体对铜绿假单胞菌生物被膜的抑制效果明显，加入MOI大于1的噬菌体即可达到很好抑制效果；本专利技术铜绿假单胞菌噬菌体能够破坏铜绿假单胞菌生物被膜，对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)生物被膜具有明显的清除作用；本专利技术噬菌体和抗生素的联合应用对生物被膜的清除作用增强；本专利技术噬菌体与常用化学清洁剂联合应用对于生物被膜的降解具有良好效果。附图说明图1为不同培养时间下的噬菌斑形态；图2为所述噬菌体(CGMCCNo.13381)的透射电镜图；图3为噬菌体(CGMCCNo.13381)对铜绿假单胞杆菌生物被膜的抑制效果；图4为噬菌体(CGMCCNo.13381)对铜绿假单胞杆菌生物被膜的破坏效果；图5为噬菌体(CGMCCNo.13381)联合抗生素对生物被膜的清除作用；图6为噬菌体(CGMCCNo.13381)联合化学清洁剂对生物被膜的降解作用。保藏信息本专利技术所提供的铜绿假单胞菌噬菌体该菌株已于2016年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏登记号为CGMCCNo.13381。具体实施方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。本专利技术铜绿假单胞菌噬菌体通过透射电镜观察，属于肌尾病毒科(Myoviridae)，头部直径约为50nm，尾长约为65nm，透射电镜图片见图2。实施例1噬菌体的分离和鉴定一噬菌体的分离取医院处理前的污水1L，加入CaCl2至1mmol/L，4℃，5000rpm离心10min，去除污水中的沉淀颗粒，取上清用0.22μm滤膜滤过除菌；取滤液20mL与20mL2×LB培养基混合，按1％的接种量，接种400μL的绿脓杆菌，37℃富集培养12h。取5ml的上述菌液4℃、5000rpm离心10min，取上清用0.22μm的滤膜滤过除菌，得噬菌体原液。把得到的噬菌体原液10倍梯度稀释，分别取300μL的稀释液与相应的对数生长期的绿脓杆菌1:1混合，37℃培养15min，与4mL55℃液体LB培养基混合，均匀倾入固体LB琼脂平板上，冷却15min倒置37℃过夜培养。次日，得到单个噬菌斑。在噬菌斑形成的平板上用枪头挑取较大的、独立的噬菌斑放入1mLSM液的EP管中，室温放置1h后4℃过夜，次日取0.1mL经过适当稀释后(10-1-10-8)，与相应的培养至对数生长期的宿主菌1:1混合做双层平板进行纯化，次日得到大小均匀的噬菌斑。得到均匀大小的噬菌斑后，对此噬菌体再次做双层平板实验(步骤如上)，分别在37℃条件下培养24h，48h后观察噬菌斑的形态，噬菌斑形态如图1。发现在噬菌斑的透明区域外面有一圈半透明的晕环，说明该噬菌体尾刺中有胞外聚合物的降解酶，该酶类能降解生物被膜胞外聚本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种铜绿假单胞菌噬菌体，其特征在于，该铜绿假单胞菌噬菌体，菌株名为vB_PaeM_QKL1，保藏号CGMCC No.13381，分类命名为铜绿假单胞菌噬菌体，于2016年12月08日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

【技术特征摘要】
1.一种铜绿假单胞菌噬菌体，其特征在于，该铜绿假单胞菌噬菌体，菌株名为vB_PaeM_QKL1，保藏号CGMCCNo.13381，分类命名为铜绿假单胞菌噬菌体，于2016年12月08日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。2.权利要求1所述铜绿假单胞菌噬菌体的应用，其特征在于，用于降解铜绿假单胞菌生物被膜。3.根据权利要求2所述铜绿假单胞菌噬菌体的应用，其特征在于，所述铜绿假单胞菌噬菌体用于以下方面：(1)制备抑制铜绿假单胞菌生物被膜形成的产品；(2)制备裂解铜绿假单胞菌生物被膜的产品；(3)制备降低铜绿假单胞菌生物被膜形成总量的产品；(4)制备与抗生素共同作用提高对铜绿假单胞菌的杀伤效率的产品；(...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐永平，渠坤丽，王丽丽，李晓宇，付丽娜，袁玉玉，丛聪，耿慧君，赵红，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21