一种真菌多糖类抗性诱导剂及其应用制造技术

本发明专利技术属于微生物领域，涉及一种真菌多糖类抗性诱导剂及其应用，命名为马勃(Calvatia sp.)DBM，并于2016年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12505；利用该真菌获得的马勃(Calvatia sp.)DBM多糖处理烟草幼苗后，烟草幼苗的鲜重、最大叶面积、叶绿素含量及净光合速率等与对照相比均明显提高。DBM多糖处理烟草叶片后，对烟草花叶病毒有较好的抑制效果。

Fungus polysaccharide resistance inducer and application thereof

The invention belongs to the field of microorganism, relates to a fungal polysaccharide induced resistance agent and its application, named DBM (Calvatia sp. Lasiosphaera), and in May 27, 2016, preserved in general microbial culture collection center China Management Committee, the preservation number is CGMCC No.12505; using the fungus obtained puffball (Calvatia sp.) DBM polysaccharide treatment of tobacco seedlings, the fresh weight, maximum leaf area of tobacco seedlings, the chlorophyll content and net photosynthetic rate were obviously higher than with the control. DBM polysaccharide has better inhibitory effect on tobacco mosaic virus when treated with tobacco leaves.

【技术实现步骤摘要】
一种真菌多糖类抗性诱导剂及其应用
：本专利技术属于真菌多糖类抗性诱导剂领域，涉及一种真菌多糖类抗性诱导剂及其应用，特别涉及一种马勃多糖的获得，以及其对烟草幼苗生长的影响及对烟草花叶病毒的抑制作用。
技术介绍
：真菌多糖是一类天然高分子化合物，它由醛糖或酮糖通过糖苷键连接在一起的多聚物构成，是生命的四大基本物质之一，广泛存在于真菌特别是大型真菌的细胞壁中，因其具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等作用而被医药界广泛关注。真菌多糖有螺旋状的三维立体结构，其构型近似于DNA，是一种β型的多糖。常见的有几丁聚糖、氨基寡糖素、菇类蛋白多糖等，烟草病毒病是烟叶生产中最重要的病害之一，被称为植物“癌症”，由于迄今为止尚无有效的防治措施，其造成的经济损失已大大超过了烟草真菌病害和细菌病害，成为威胁烟草生产的最大的一类灾害。植物抗病诱导剂因其环境友好性、系统性、广谱性等优点已经被广泛研究和应用，潜力巨大。国内外已报道有大量的抗病诱导剂研制并成功应用。许多研究表明，许多大型真菌多糖不仅具有抑杀真菌和病毒的作用，而且能够调节作物生长，诱导植物产生抗性。作为天然化合物，真菌多糖还具有无毒、易被降解、对环境无污染等特性，使其有可能作为一种新型植物抗病诱导剂在农业生产中发挥作用。而马勃是常用的药用真菌，其药用成分包括马勃多糖、甾体类化合物等，在抗肿瘤、抗炎、止血和抑菌等方面有广泛的应用价值，但在诱导植物抗病性和促生等方面尚未见相关研究和报道。
技术实现思路
针对现有技术存在的诸多不足之处，本专利技术首先提供了一种大型真菌，命名为马勃(Calvatiasp.)DBM，并于2016年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12505；利用该真菌获得的马勃(Calvatiasp.)DBM多糖处理烟草幼苗后，烟草幼苗的鲜重、最大叶面积、叶绿素含量及净光合速率等与对照相比均明显提高。DBM多糖处理烟草叶片后，对烟草花叶病毒有较好的抑制效果。本专利技术是通过如下技术方案实现的：本专利技术首先提供了一种大型真菌马勃，马勃样品由专利技术人于2015年8月采自山东泰山，并分离获得菌种，菌种现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。获得上述真菌后，专利技术人对其进行了生物保藏，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12505；在上述真菌的基础上，专利技术人进一步给出了利用其制备马勃多糖的方法如下：用5mm打孔器从DBM菌落边缘打取直径5mm的菌落圆片，挑取一片接种于PDA培养基中央，放置于28℃恒温箱中培养7d后，采用相同的方法在菌落边缘打取直径5mm的菌落圆片4-5片转接于装有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，28℃，220rpm培养7d，5000rpm离心10min收集菌丝体，无菌水充分洗涤；其中所述的DBM菌落为保藏编号为CGMCCNo.12505的马勃真菌菌落；所述发酵培养基组成按重量百分比计为：冷榨豆饼粉，1％；酵母粉，0.2％；蔗糖，3％；硫酸镁，0.05％；磷酸二氢钾，0.1％；维生素B1，0.01％，余量为无菌去离子水；菌丝体于65℃烘箱烘至恒重，干菌丝在研钵中研细，过80目筛子制成干粉；菌丝体干粉加40倍体积水80℃水浴浸提2h，重复两次，合并两次提取液，浓缩至原体积的1/15，向浓缩液中缓慢加入3倍体积的95％乙醇，4℃静置过夜后8000rpm离心10min留取沉淀，沉淀分别以95％乙醇洗涤一次、丙酮洗涤两次，真空干燥得到多糖粗提物。对粗提物的理化性质进行初步鉴定发现，该粗提物为白色粉末，溶于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚和正丁醇。粗提物溶于水后为透明溶液，在较高浓度时呈粘稠状。Molish反应中，在粗提物溶液和浓硫酸的液面交界处形成紫环，表明粗提物中含有多糖成分。粗提物溶液与Fehling试剂反应均显阴性，没有砖红色沉淀产生，表明不含有还原性糖。通过用苯酚-硫酸法测定得知上述获得的DBM多糖粗提物中的总糖含量为84.9％。专利技术人进一步对上述获得的多糖粗提物进行了功能研究，结果如下：将上述多糖粗提物溶解后可获得不同浓度的多糖溶液，选择1000mg/L和2000mg/L两个浓度的多糖溶液喷雾处理烟苗，结果发现：处理后的烟苗地上部鲜重、地下部鲜重和最大叶面积与对照相比均有显著提高，分别比对照增加53.6％、233.3％和36.6％，总叶绿素含量和光合速率分别比对照增加37.5％和97.1％，表明多糖处理明显促进烟苗的生长。同时专利技术人利用半叶枯法测定了上述多糖粗提物对TMV的钝化、治疗和预防作用，结果发现，经多糖处理后，烟苗对TMV预防效果最好，经1000mg/L和2000mg/L两种浓度处理后枯斑数分别比对照减少8.2个和12.8个，预防效果分别为60％和74％；多糖对TMV的钝化效果次之，两种浓度处理后的钝化效果分别为18.2％和17.7％；烟苗对TMV的治疗效果：两种浓度处理后其治疗效果均低于40％，与其他两种处理方式相比，相对较差但依然有一定的效果。差异显著性分析表明，两种多糖浓度处理后，对TMV的抑制效果差异不显著。综上所述，本专利技术提供了一种新的马勃真菌，并对其进行了生物保藏，而利用该真菌获得的马勃(Calvatiasp.)DBM多糖处理烟草幼苗后，烟草幼苗的鲜重、最大叶面积、叶绿素含量及净光合速率等与对照相比均明显提高。DBM多糖处理烟草叶片后，对烟草花叶病毒有较好的抑制效果。专利技术人对本专利技术所公开的大型真菌，命名为马勃Calvatiasp.，并对其进行了生物保藏，具体保藏信息如下：保藏信息保藏时间：2016年5月27日保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏编号：CGMCCNo.12505保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所分类命名:马勃Calvatiasp.附图说明图1为实施例1中三种不同培养基对DBM菌丝生长的影响示意图；从图中可以看出3种液体培养基中以C配比效果最好；图2为实施例3中葡萄糖浓度标准曲线；从图中可以看出该标准曲线线性良好，可以用于计算粗提物的总糖含量；图3为DBM多糖对烟草幼苗生长的影响结果灰度示意图；从图中可以看出经两种浓度的多糖处理后，烟苗叶色浓绿，根系较发达，说明多糖溶液对烟草幼苗的生长具有较好的促进效果；图4为DBM多糖处理对TMV的钝化效果灰度示意图；图5为DBM多糖处理对TMV的预防效果灰度示意图；图6为DBM多糖处理对TMV的治疗效果灰度示意图；由图4、图5及图6可见，经两种浓度的多糖溶液处理后，枯斑数明显比对照减少，表明多糖处理增强了烟草对TMV的抗性。具体实施方式实施例1培养基的筛选DBM母种接种于PDA固体培养基上，放置于28℃恒温箱中培养，培养6～7d后挑取一环于液体培养基中，28℃，220rpm培养，7d后将培养液5000rpm离心10min，回收菌丝体并洗涤。菌丝体于65℃烘箱烘至恒重，称重后比较差异。三种不同液体培养基配方:培养基A：冷榨豆饼粉，1％；蛋白胨，0.2％；葡萄糖，3％；硫酸镁，0.05％；磷酸二氢钾，0.1％；维生素B1，0.01％；培养基B：葡萄糖，2％；磷酸二氢钾，0.3％；硫酸镁，0.15％；维生素B1，0.1％，马铃薯汁，20％；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种马勃真菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12505。

【技术特征摘要】
1.一种马勃真菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12505。2.一种马勃多糖，其特征在于：其来源于保藏编号为CGMCCNo.12505的马勃真菌。3.一种马勃多糖的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：用5mm打孔器从DBM菌落边缘打取直径5mm的菌落圆片，挑取一片接种于PDA培养基中央，放置于28℃恒温箱中培养7d后，采用相同的方法在菌落边缘打取直径5mm的菌落圆片4-5片转接于装有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，28℃，220rpm培养7d，5000rpm离心10min收集菌丝体，无菌水充分洗涤；其中所述的DBM菌落为保藏编号为CGMCCNo.12505的马勃真菌菌落；菌丝体于65℃烘箱烘至恒重，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘爱新，张莉，李现道，包自超，杜传印，刘春菊，
申请(专利权)人：山东农业大学，山东烟草研究院有限公司，山东潍坊烟草有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37