一种调控人体固有免疫的全人源单克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种调控人体固有免疫的全人源单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明专利技术还公开了编码所述抗体的完整基因及氨基酸序列。本发明专利技术从全人源抗体杂交瘤细胞库中筛选出调控人体固有免疫的单克隆抗体，通过大规模培养收集细胞培养上清，经过亲和柱纯化获得。通过对抗体基因测序获得该抗体cDNA序列，并克隆到真核表达载体中，通过人体细胞表达系统大规模培养，经过亲和柱纯化获得该抗体。研究表明，本发明专利技术得到的全人源单克隆抗体能够调控人体固有免疫，激活I型IFN信号系统，并且能够抑制病毒增殖，因此本发明专利技术的全人源单克隆抗体可用于感染性疾病、肿瘤及免疫系统疾病的预防和治疗。

Human full source monoclonal antibody for regulating innate immunity of human body, preparation method and application thereof

The invention discloses a whole human source monoclonal antibody for regulating the innate immunity of human body, a preparation method and an application thereof. The present invention also discloses the complete gene and amino acid sequence encoding the antibody. The monoclonal antibody which regulates the innate immunity of the human body is screened from the human full source antibody hybridoma cell library, and the supernatant of the cell culture is collected by large-scale culture and purified by affinity column. The antibody cDNA sequence was obtained by sequencing the antibody gene and cloned into eukaryotic expression vector. The antibody was purified by affinity column and cultured in large scale by human cell expression system. Research shows that fully human monoclonal antibody of the invention can regulate human innate immunity, activation of I IFN signaling system, and can inhibit the proliferation of the virus, so the whole human monoclonal antibody of the invention can be used for infectious diseases, tumor and immune system disease prevention and treatment.

【技术实现步骤摘要】
一种调控人体固有免疫的全人源单克隆抗体及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种全人源单克隆抗体及其制备方法和应用，特别涉及一种调控人体固有免疫的全人源单克隆抗体及其制备方法和在调控人体固有免疫中的用途，本专利技术属于医药

技术介绍
单克隆抗体(monoclonalantibody)是继疫苗、重组蛋白后最重要的一类生物技术产品，具有明确的作用位点，与靶位点亲和力高，已成功应用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等。单抗技术经历40年的发展，经历鼠源性(murine)、嵌合体(chimeric)、人源化(humanize)和全人源(fullhuman)四个阶段(图1)。鼠源性单抗由鼠杂交瘤细胞分泌，免疫原性非常强，可诱导产生人抗鼠抗体，毒副作用明显；嵌合体单抗是将鼠源性单抗的Fab段保留，Fc段为人源性；人源化抗体是指抗体的恒定区部分(即CH和CL区)由人类抗体基因所编码；全人源单抗是指所有部分均由人类抗体基因所编码。全人源单克隆抗体不良反应小、半衰期长，疗效好，是未来研究发展的方向。全人源单克隆抗体靶向性强，特异性高、毒副作用低，在疾病机制的研究、疾病的诊断和治疗领域中得到了有力推广。全人源单克隆抗体Tanibirumab进行玻璃体内注射，具有抗血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactorreceptor)2的作用，能部分地抑制大鼠模型激光诱导脉络膜新生血管。胎盘钙粘蛋白(P-cadherin)介导肿瘤细胞的黏附、增殖和侵袭，全人源抗P-cadherin抗体PF-03732010通过干扰P-cadherin信号途径抑制原发肿瘤的生长和转移。固有免疫是机体抵抗病原微生物的第一道防线，病毒感染后诱导的I型干扰素(interferon,IFN)是人体抗病毒天然免疫反应的重要介导因子。病毒、细菌或其它IFN诱生剂通过与细胞膜作用后，促使I型IFN基因脱抑制而被激活，开始转录形成IFN-α和IFN-β的mRNA，并在胞浆核糖体上进一步翻译成I型IFN的前体，I型IFN前体被转运至细胞膜上，前体最终被剪切为成熟的I型IFN。I型IFN信号传导的经典通路——JAK/STAT(januskinase/signaltransducersandactivatorsoftranscription)路径：IFN-α和IFN-β与其相应的受体偶联后，导致I型IFN受体酪氨酸残基的磷酸化，促使细胞内与受体耦联的JAK酪氨酸激酶被激活，JAK的活化再进一步促使STAT磷酸化，形成同源或者异源二聚体。活化的二聚体与结合蛋白结合组成三聚体，进一步转移到细胞核内，引起一系列抗病毒蛋白(antiviralprotein,AVP)基因的表达，从而发挥I型IFN的各种生物学活性。目前全人源单克隆抗体是治疗性抗体发展的主要方向，本专利技术通过人源杂交瘤技术获得了全人抗体克隆库，为抗体的制备筛选提供了良好的技术平台，筛选出来的抗体为人体内自然产生的抗体，避免了人源化过程引入的人为加工因素，更符合人体内的自然生理过程，具有广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可用于调控人体固有免疫、激活I型IFN信号系统的全人源单克隆抗体及其制备方法。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：(1)从全人抗体库中筛选获得了一株能够促进I型IFN表达升高的人杂交瘤细胞株。(2)扩增、纯化该全人源单克隆抗体，评价该抗体对正常肝细胞的安全性。(3)对获得的单克隆抗体与肿瘤细胞作用进行生物学功能鉴定和比较，结果表明该全人源单克隆抗体能促进I型IFNmRNA表达增加，抑制乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)HBeAg的表达，与HepG2.215细胞(来源于HepG2细胞，里面转染了两段完整的HBV全基因)能够结合。(4)对产生该抗体的杂交瘤细胞进行抗体基因测序；(5)将(4)中所述单克隆抗体重链序列和轻链序列克隆到真核表达载体，转染宿主细胞，获得的单克隆抗体再进行亲和力和其他生物学功能比较。在上述研究的基础上，本专利技术筛选得到一株能够调控人体固有免疫的全人源单克隆抗体，由轻链和重链组成，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.6所示，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.8所示。在本专利技术中，优选的，所述轻链的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，所述重链的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。本领域技术人员将知晓的是，抗体中的保守性氨基酸替换并不会实质性地影响抗体的亲和力和结构，尤其是所述保守性替换发生在恒定区时。因此，若氨基酸的变化发生在恒定区且变化后并不影响抗体的生物学活性，那么该抗体也应在本专利技术的保护范围之内。进一步的，本专利技术还提出了包含所述全人源单克隆抗体的单个重链和/或单个轻链的单域抗体、嵌合抗体、抗体融合蛋白抗体、抗体/抗体片段-因子融合蛋白或抗体/抗体片段-化学偶联物。以及所述的全人源单克隆抗体的抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段可选自Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd'片段。再进一步的，本专利技术还提出了一种分离的DNA分子，其为编码所述的抗体或所述的抗原结合片段的核苷酸序列，优选的，所述的核苷酸序列包含SEQIDNO:5和/或SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，更优选的，所述的核苷酸序列包含SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。含有所述的核苷酸序列或其组合的重组DNA表达载体以及含有所述的核苷酸序列或所述的重组DNA表达载体的宿主细胞也在本专利技术的保护范围之内，优选的，所述的宿主细胞选自原核细胞、酵母或哺乳动物细胞，更优选的，所述宿主细胞选自HEK293F细胞、CHO细胞或NSO细胞。所述HEK293F细胞为人胚肾293F细胞(humanembryonickidney293Fcell)；CHO细胞为中国仓鼠卵巢细胞(chinesehamsterovarycell)；NSO细胞为小鼠NSO胸腺瘤细胞(mousethymomaNSOcells)。更进一步的，本专利技术还提出了所述的抗体、所述的抗原结合片段、所述的核苷酸序列、所述的载体或所述的宿主细胞在制备调控人体固有免疫，激活I型IFN信号系统的药物中的用途，所述药物是用于预防和治疗感染性疾病、肿瘤及免疫系统疾病。其中，优选的，所述感染性疾病包括但不限于HIV病毒感染、甲型、乙型和丙型肝炎病毒感染、疱疹病毒感染、流感病毒感染、柯萨奇病毒感染、呼吸道合胞病毒感染、人乳头瘤病毒感染、EB病毒感染、肠道病毒71型感染；所述肿瘤包括但不限于胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴癌、黑色素瘤、急性或慢性白血病、肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌、头颈癌、结直肠癌、实体瘤；所述免疫系统疾病包括不限于系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、重症肌无力、多发性硬化症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、硬皮病、结节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病。更进一步的，本专利技术还提出了制备调控人体固有免疫的全人源单克隆抗体的方法，包括如下步骤：(1)提供表达载体，所述表达载体含有编码抗体或抗原结合片段的DNA分子，以及与所述D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种调控人体固有免疫的全人源单克隆抗体，由轻链和重链组成，其特征在于所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示。

【技术特征摘要】
1.一种调控人体固有免疫的全人源单克隆抗体，由轻链和重链组成，其特征在于所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.6所示，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.8所示。2.如权利要求1所述的调控人体固有免疫的全人源单克隆抗体，其特征在于所述轻链的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，所述重链的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。3.包含权利要求1或2所述全人源单克隆抗体的单个重链和/或单个轻链的单域抗体、嵌合抗体、抗体融合蛋白抗体、抗体/抗体片段-因子融合蛋白或抗体/抗体片段-化学偶联物。4.权利要求1或2所述的全人源单克隆抗体的抗原结合片段，其特征在于所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd'片段。5.一种分离的DNA分子，其特征在于所述DNA分子为编码权利要求1-3任一项所述的抗体或权利要求4所述的抗原结合片段的核苷酸序列，优选的，所述的核苷酸序列包含SEQIDNO:5和/或SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，更优选的，所述的核苷酸序列包含SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。6.含有权利要求5所述的核苷酸序列或其组合的重组DNA表达载体。7.含有权利要求5所述的核苷酸序列或权利要求6所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，优选的，所述的宿主细胞选自原核细胞、酵母或哺乳动物细胞，更优选的，所述宿主细胞选自HEK293F细胞、CHO细胞或NSO细胞。8.权利要求1-3任一项所述的抗体、权利要求4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张凤民，翟爱霞，宋武琦，考文萍，吴静，郭彩玲，卜桐，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23