一种激活的中性粒细胞膜包覆的仿生纳米粒子及制备方法技术

本发明专利技术属于药物制剂领域，涉及一种激活的中性粒细胞膜包覆的仿生纳米粒子及制备方法。本发明专利技术中以聚合物聚乳酸‑羟基乙酸共聚物PLGA，或聚乳酸共聚物PLA，或聚己内酯共聚物PCL为材料制备纳米粒作为内核并包载模型药物，将天然激活中性粒细胞膜作为衣壳包覆于纳米粒表面，制成激活的中性粒细胞膜包覆的生物可降解的仿生粒子纳米载体系统。经体内外实验表明，该仿生粒子纳米载体系统能针对循环肿瘤细胞及微转移灶的仿生治疗系统具有靶向性强、高效的特点，为个体化和精准治疗提供了新的思路，具有较高的临床实践意义。

Bionic nano particle covered by activated neutrophil cell membrane and preparation method thereof

The invention belongs to the field of pharmaceutical preparation, and relates to a bionic nano particle covered by activated neutrophil cell membrane and a preparation method thereof. The present invention in polymer poly lactic acid glycolic acid or polylactic acid copolymer PLGA, PLA, or polycaprolactone copolymer PCL as the material for the preparation of nanoparticles as core and encapsulation of model drugs, natural activated neutrophil membrane as the capsid is coated on the surface of the nanoparticles, a bionic particle nano carrier system biodegradable activated neutrophils the membrane coating. The in vivo experiments show that the bionic nano particles carrier system for circulating tumor cells and micrometastases in the treatment of bionic system has the characteristics of strong targeted and efficient, and provides a new idea for individualized and precise treatment, has high clinical practical significance.

【技术实现步骤摘要】
一种激活的中性粒细胞膜包覆的仿生纳米粒子及制备方法
本专利技术属药物制剂
，涉及抗肿瘤药物的仿生纳米制剂，具体涉及一种激活的中性粒细胞膜包覆的仿生纳米粒子及制备方法，尤其是一种能包载脂溶性药物的具有聚合物-细胞膜核壳结构的仿中性粒细胞的纳米载体及其制备方法。
技术介绍
资料显示，恶性肿瘤是目前危害人类健康的主要杀手，具有侵袭性和转移能力是其最重要的生理特征。临床实践中，手术、化学治疗等干预手段虽然在短期内能起到一定作用，但预后一般较差，肿瘤的复发和转移是治疗面临的最大挑战。研究显示肿瘤转移中血管是肿瘤细胞侵入机体各个器官的主要“高速公路”，肿瘤表皮细胞大量增殖脱落，侵入血管形成具有高侵袭力和运动能力的循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells,CTC)，这种具有内皮细胞样形态的CTC到达远处合适的寄居部位，形成转移灶，成为日后致命的隐患，也是临床肿瘤治疗失败的根本原因所在。现有技术公开了人体白细胞可分为多种亚群，包括中性粒细胞、淋巴细胞以及单核细胞等，研究发现占白细胞总数70％左右的中性粒细胞对CTC和转移部位具有天然靶向作用，其分子基础在于这两种细胞表面的粘附分子表达的改变，即肿瘤微环境中的炎性因子激活中性粒细胞，上调其细胞膜上的粘附分子表达，增强了中性粒细胞与CTC高表达的特异性配体亲和力从而介导了肿瘤的转移。基于激活中性粒细胞对CTC高效靶向的生物学基础，本申请的专利技术人拟提供一种激活的中性粒细胞膜包覆的生物可降解的仿生粒子，具体涉及一种能包载脂溶性药物的具有聚合物-细胞膜核壳结构的仿中性粒细胞的纳米载体系统，该系统将在血循环中高度靶向并杀伤CTC，从而抑制肿瘤的转移。
技术实现思路
本专利技术的目的在于构建一种表面包覆激活的中性粒细胞膜的生物可降解的仿生粒子(neutrophillikenanopartiles,简称NLP)及其制备方法。本专利技术以聚合物聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)，简称PLGA)，或聚乳酸共聚物(polylacticacid，简称PLA)，或聚己内酯共聚物(Polycaprolactone，简称PCL)为材料制备纳米粒作为内核并包载模型药物，将天然激活中性粒细胞膜作为衣壳包覆于纳米粒表面，制成激活的中性粒细胞膜包覆的生物可降解的仿生粒子纳米载体系统。该纳米载体系统中，一方面利用激活的生物膜蛋白，在血液中长循环并高度靶向杀伤CTC；另一方面利用中性粒细胞天然募集至炎症部位血管的原理，靶向炎症状态的早期微转移病灶并释放药物，从而抑制肿瘤的转移。本专利技术中，采用的模型药物为卡非佐米、硼替佐米或紫衫烷类化疗药物，均为FDA批准的小分子化疗药物；其中，卡非佐米、硼替佐米或紫衫烷类化疗药物，能作用于多种与转移、耐药相关的通路，诱导肿瘤细胞凋亡，具有一定抑制肿瘤转移活性，将这些化疗药物包载于上述纳米载体中，一方面能够延长其在血液中的半衰期，诱导循环肿瘤细胞凋亡；另一方面能够抑制基质金属蛋白酶和相关炎症因子的生成，调节早期微转移病灶局部炎症环境，遏制肿瘤细胞的定植和侵袭。本专利技术中，聚合物PLGA，PLA，PCL构建的纳米粒作为内核，能包载疏水性药物，具有较高的机械稳定性，其分子量为10000-30000Da。本专利技术中，所述中性粒细胞膜囊泡通过从同种类动物外周血分离得到中性粒细胞，将其进行体外诱导从而上调相关粘附分子的表达，采用差速离心法提取得到；本专利技术中，所述激活的中性粒细胞膜表面相关粘附分子中，LPS脂多糖激活的中性粒细胞膜上调β2整合素类、L-选择素、趋化因子受体、β1整合素等膜蛋白的表达。本专利技术通过下述方法构建粒子方法仿生粒子纳米载体系统：①从同种类动物外周血分离得到中性粒细胞，将其进行体外诱导从而上调相关粘附分子的表达，差速离心法提取得到细胞膜分散于水溶液中的囊泡；②以PLGA或PLA或PCL为材料采用乳化溶媒挥发法制得粒径均一的纳米粒，同时包载难溶性小分子模型药物；③将预先制备的中性粒细胞膜囊泡与PLGA或PLA或PCL纳米粒共孵育并往复过膜挤压。本专利技术中，所述外周血细胞物种来源是小鼠或者大鼠。本专利技术中，所述聚合物构建的纳米粒内核和细胞膜囊泡通过疏水作用以及静电作用相结合，在聚合物内核表面包被膜-蛋白脂质双分子层，形成核壳结构的纳米级仿生粒子。本专利技术中，所述细胞膜囊泡平均粒径为200nm左右，聚合物纳米内核平均粒径为80-100nm，包被中性粒细胞膜之后最终粒径在100-120nm左右；相比于微米尺度的细胞，比表面积较大，能更高效地发挥膜结构的作用。本专利技术采用人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)为早期微转移病灶内皮细胞模型，以改良的椎板粘度计对乳腺癌肺高转移细胞(4T1细胞)产生一定剪切力为循环肿瘤细胞模型，此两种细胞均为本领域公认且熟知。本专利技术描述了该药物递释系统的制备方案，并提供了该系统体内外靶向性的结果以及药效学评价。本专利技术通过采用改良的锥板粘度计模拟血液流动状态，评价在一定的血液剪切力作用下NLP对流动状态的4T1肿瘤细胞的靶向功能，并且能够显著提高卡非佐米诱导流动状态的4T1细胞的凋亡的能力。肺转移模型裸鼠活体近红外/生物发光双模成像实验证明，该药物能够特异性地蓄积至肺转移病灶。体内药效学评价监测显示，相比于游离药物和普通纳米制剂，该递药系统能够显著抑制转移病灶的形成，具有明显的抗肿瘤效果。本专利技术所制得的新型靶向药物递释系统其给药方式为静脉注射。本专利技术的优点在于：制得的仿生粒子纳米载体系统不同于一种或者多种分子修饰的主动靶向纳米粒子，该简易的中性粒细胞仿生粒子(Neutrophil-likeparticles,NLP)在防治肿瘤转移方面具有其独特的优势：①激活的中性粒细胞膜表面相关粘附分子能高度靶向CTC；②PLGA或PLA或PCL内核载药能力强，且具缓释效果；③纳米粒利用中性粒细胞膜的伪装，能够逃避自身单核巨噬细胞的吞噬，有别于传统的聚乙二醇修饰，为实现制剂的长循环提供新思路；④生物相容性和安全性高：NLP表面包覆的中性粒细胞膜不存在遗传物质以及细胞器等，免疫原性极低；内核为FDA所认可的生物可降解材料；因此具有较高的安全性和医学转化前景。附图说明：图1是纳米递药系统的粒径和电位表征图，图中A,B,C分别是几种纳米制剂的粒径分布，平均粒径和Zeta电位。图2是纳米递药系统的透射电镜图，图中A,B,C分别是裸露的PLGA纳米粒，中性粒细胞膜囊泡和包被中性粒细胞膜的PLGA纳米粒透射电镜放大图，D是包被中性粒细胞膜的PLGA纳米粒分散于水溶液中。图3是纳米粒表面粘附和趋化蛋白的定性检测结果，图中A是免疫印迹法测定L-selectin,CXCR4,LFA-1,β1intergrin等几类蛋白在样品中的表达情况；(a)中性粒细胞,(b)中性粒细胞膜，(c)包被中性粒细胞膜的纳米粒，(d)经过LPS刺激后的中性粒细胞，(e)经过LPS刺激后的中性粒细胞膜，(f)经过LPS刺激后的中性粒细胞膜包被的纳米粒；B是考马斯亮蓝染色法测定经过LPS刺激后的中性粒细胞，中性粒细胞膜，纳米粒表面的总体蛋白印记。图4是免疫印迹法测定粘附和趋化分子表达的半定量结果，图中***p<0.001，是指与未经过LPS刺激的中性粒细胞相本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种激活的中性粒细胞膜包覆的仿生纳米粒子，其特征在于，以聚合物聚乳酸‑羟基乙酸共聚物PLGA，或聚乳酸共聚物PLA，或聚己内酯共聚物PCL为材料制备纳米粒作为内核并包载模型药物，将天然激活中性粒细胞膜作为衣壳包覆于纳米粒表面，制成激活的中性粒细胞膜包覆的生物可降解的仿生粒子纳米载体系统。

【技术特征摘要】
2015.12.31 CN 201511027251X1.一种激活的中性粒细胞膜包覆的仿生纳米粒子，其特征在于，以聚合物聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA，或聚乳酸共聚物PLA，或聚己内酯共聚物PCL为材料制备纳米粒作为内核并包载模型药物，将天然激活中性粒细胞膜作为衣壳包覆于纳米粒表面，制成激活的中性粒细胞膜包覆的生物可降解的仿生粒子纳米载体系统。2.按权利要求1所述的激活的中性粒细胞膜包覆的仿生纳米粒子，其特征在于，所采用模型药物为卡非佐米、硼替佐米或紫衫烷类化疗药物。3.按权利要求1所述的激活的中性粒细胞膜包覆的仿生纳米粒子，其特征在于，所述的仿生纳米粒子为核壳结构的纳米级仿生粒子，由聚合物聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA，或聚乳酸共聚物PLA，或聚己内酯共聚物PCL构建成的纳米内核，以及中性粒细胞膜囊泡的蛋白脂质双分子层外壳通过疏水作用以及静电作用相结合。4.按权利要求1所述的激活的中性粒细胞膜包覆的仿生纳米粒子，其特征在于，所述聚合物PLGA，PLA，PCL构建的纳米粒作为内核，其分子量为10000-30000Da，能稳定包载疏水性药物。...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈钧，康婷，朱倩倩，冯静娴，姚建辉，蒋天泽，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31