一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂及其制备方法及应用。本发明专利技术提供的经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂的制备方法，包括步骤为：种子细胞培养与纯化；P6—P8代细胞培养；工作细胞库；用于帕金森病的治疗制剂的配制。本发明专利技术利提供的经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂及其制备方法及应用，该制剂滴加或注射入鼻腔后在体温条件下能迅速形成固态膜状，吸附于鼻腔待细胞进行缓慢吸收，并且不会随呼吸进入口腔或肺部，便捷了病人和医生的使用，且试验数据表明其的疗效和安全性比从创伤性的纹状体给药更好。该制剂可用于治疗帕金森疾病，且不需要使用免疫抑制剂。

A neural stem cell preparation used in the treatment of Parkinson's disease by nasal administration

The invention belongs to the field of biological medicine, in particular to a neural stem cell preparation for treating Parkinson's disease through nasal cavity administration, a preparation method and an application thereof. The present invention provides the intranasal preparation method for the treatment of Parkinson's disease cell preparation comprises the following steps: neural stem cell culture and purification of seed; P6 - P8 cellculture; working cell bank; used to make therapy of Parkinson's disease. The invention provides the intranasal drug for the treatment of Parkinson's disease neural stem cell preparation and its preparation method and application of the preparation, dripping or injected into the nasal cavity in the body temperature can quickly form a solid film, to be adsorbed on the nasal cells were slowly absorbed, and not with the breath into the mouth or lungs, convenient the use of patients and doctors, and the experimental data show that the efficacy and safety of the ratio from the traumatic striatal administration better. The formulation may be used in the treatment of Parkinson's disease without the use of immunosuppressive agents.

【技术实现步骤摘要】
一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂
本专利技术涉及属于生物医药领域，具体涉及一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂及其制备方法及应用。
技术介绍
帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是临床上较为常见的难治病症，以黑质多巴胺能神经元变性缺失以及路易小体形成为主要病理特点，临床表现主要为静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异常，极大影响了患者的生存质量。从19世纪60年代晚期开始，通过口服左旋多巴的多巴胺替代疗法来缓解PD运动症状是现代神经科学转化研究中的成功之一。目前，左旋多巴仍是治疗有症状PD的金标准。PD治疗目前最为有效的方法是采用左旋多巴替代治疗，但仍不能有效阻止或减缓疾病的发展。目前只能采用药物、外科手术或电极的方式进行缓解和控制症状，避免发展速度过快。自二十世纪八十年代初开展的细胞移植治疗PD以来，人们已尝试过胚胎中脑黑质组织、自体肾上腺髓质，胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓干细胞、人畸胎瘤神经元等，并取得了一定的疗效，因此细胞移植治疗PD也越来越多的受到关注。但上述细胞来源均受供体(donors)资源匮乏、伦理问题、成瘤风险大、免疫排斥反应、诱导多巴胺能神经元比例低等问题困扰，限制了细胞移植治疗帕金森病的进程。目前临床治疗帕金森病的方法以口服DA前体药物左旋多巴为主，但这种药物起初有效，长期服用则会出现疗效下降，并引起一系列运动障碍并发症。外科治疗以苍白球和丘脑的损毁为主要方法，但术后复发率高。上述方法属于对症治疗，但不能逆转DA能神经元的变性，因此，找到一种能够替代变性的多巴胺能神经细胞以恢复多巴胺神经递质功能的新技术新方法，已成为迫在眉睫的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂及其制备方法及应用。本专利技术与鼠神经生长因子等神经营养药不同，神经干细胞注射液来源自人类胚胎(通过伦理审查)，完全100％人源，并且采用鼻腔无创给药的方式，直接作用于中枢神经系统，预计对小儿脑瘫将有更好的疗效。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术涉及一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂，所述方法包括如下步骤：S1：种子细胞培养与纯化：将原代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增传代至P5代即为获得的种子细胞。原代神经干细胞可以是在显微镜下使用手术器械分离获得废弃胎脑的腹侧中脑组织，然后采用消化液将细胞进行消化，细胞计数后使用无血清完全培养基进行重悬，并接种于超低吸附培养瓶中，35℃5％CO2培养箱中进行悬浮培养，每间隔48-72小时进行换液，细胞连续培养12天左右即可传代，连续培养至P5代，在P0代到P5代这个过程里，所得的细胞越来越纯。将所得的P0-P5代细胞放入种子细胞库中进行存储。本专利技术所述神经干细胞可以是不同动物例如哺乳动物例如灵长类动物例如人、啮齿类动物例如鼠等的神经干细胞，而且所述神经干细胞可以得自不同来源，例如可以商购获得的神经球冻存液或神经干细胞细胞系，或者是间充质干细胞向神经方向诱导获得的神经干细胞；或者是由其他来源经诱导分化而来的神经干细胞，比如iPSC技术，胚胎干细胞(包括极小类胚胎干细胞)，亚全能干细胞，人类视网膜色素上皮细胞等；或者是除神经组织器官以外的其他器官及组织而来的神经干细胞，比如脐带血和脐带。S2：P6—P8代细胞培养：将步骤S1中得到的P5代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增传代至P8代。所述培养扩增传代的方法为将细胞培养瓶采用层粘连蛋白Laminin在37℃包被2小时，然后采用不含Ca、Mg的DPBS洗涤一遍备用；将P5代神经干细胞消化计数后，采用无血清完全培养基进行重悬，并调整密度为1x105个/ml，接种于包被好的培养瓶中，置于35℃5％CO2环境进行贴壁培养；细胞培养每间隔48小时进行换液，细胞连续培养7天左右即可传代，直至P8代，期间P6-P8细胞放入主细胞库进行存储。S3：工作细胞库：取步骤S2中P8代细胞，进行细胞特性和异源物质检测，检测合格后，即为工作细胞，将其进行消化冻存，并转移至工作细胞库待用。优选的，步骤S2中所述无血清培养基是由DMEM/F12，B27，N2，以及神经营养因子BFGF,EGF,LIF组成，无任何动物源血清成分。S4：用于帕金森病的治疗制剂的配制：将步骤S3的工作细胞进行贴壁培养，待细胞生长至对数生长期时将细胞进行消化并计数；然后在0-4度条件下将工作细胞溶液与塑形剂按体积比1：1进行混合；所述工作细胞溶液的浓度为100微升2.5x106个工作细胞；所述塑性剂为Matrigel与0.4％羧甲基纤维素钠溶液按体积比1:1进行混合。如果工作细胞是从工作细胞库中的取出的冻存工作细胞先应进行复苏后，再进行贴壁培养，待细胞生长至对数生长期时将细胞进行消化并计数；然后在0-4度条件下将100微升2.5x106个神经干细胞与100微升塑形剂轻轻混匀，并转移至预冷的容器中，于4℃恒温环境保存。上述的经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂的使用方法，将所述的经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂取出，滴至鼻腔粘膜或注射至皮下。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1.本专利提供了一种无创的经鼻腔粘膜吸附给药的治疗帕金森的神经干细胞制剂，该制剂滴加或注射入鼻腔后在体温条件下能迅速形成固态膜状，吸附于鼻腔待细胞进行缓慢吸收，并且不会随呼吸进入口腔或肺部，便捷了病人和医生的使用，且试验数据表明其的疗效和安全性比从创伤性的纹状体给药更好。2.本专利中神经干细胞的培养方法采用P0-P5为悬浮培养、P6-P9为贴壁培养的方式，前期悬浮培养有利于获得纯化的神经干细胞克隆，能够保证获得的神经干细胞的纯度，而贴壁培养能够使神经干细胞更快的增殖传代，有利于细胞的中试扩大培养，并且能缩短接近一半的培养时间。3.本专利提供了一种性能稳定、哺乳动物来源的神经干细胞制剂，该制剂可在哺乳动物脑内分化成多巴胺受体的神经元，少突胶质细胞和星状胶质细胞，可修复大脑的神经和组织。4.该制剂可用于治疗帕金森疾病，且不需要使用免疫抑制剂。附图说明图1为神经干细胞形态，左图为悬浮培养的神经干细胞球；右图为贴壁培养的神经干细胞；细胞增殖倍数可达10倍/代次。图2为神经干细胞细胞特性和分化能力的鉴定；A-E为神经干细胞特性鉴定，F-M为神经干细胞分化能力的鉴定。图3为流式鉴定神经干细胞的纯度(＞95％)。图4为神经干细胞给药后各组动物黑质区域免疫组化染色结果。图5为神经干细胞给药后神经递质DOPAC相对含量变化。图6为神经干细胞给药后神经递质HVA相对含量变化。图7为各标准品的HPLC检测图谱。图8为神经干细胞给药后各组组织样品的HPLC检测图谱。图9为神经干细胞给药后不同组大鼠跨步试验结果比较。图10为神经干细胞给药后第10周不同组大鼠跨步试验结果比较。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。实施例1：神经干细胞种子库细胞的获得1、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1：种子细胞培养与纯化：将原代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增传代至P5代即为获得的种子细胞；S2：P6—P8代细胞培养：将步骤S1中得到的P5代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增传代至P8代；S3：工作细胞库：取步骤S2中P8代细胞，进行细胞特性和异源物质检测，检测合格后，即为工作细胞，将其进行消化冻存，并转移至工作细胞库待用；S4：用于帕金森病的治疗制剂的配制：将步骤S3的工作细胞进行贴壁培养，待细胞生长至对数生长期时将细胞进行消化并计数；然后在0‑4度条件下将工作细胞溶液与塑形剂按体积比1：1进行混合；所述工作细胞溶液的浓度为100微升2.5x10

【技术特征摘要】
1.一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1：种子细胞培养与纯化：将原代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增传代至P5代即为获得的种子细胞；S2：P6—P8代细胞培养：将步骤S1中得到的P5代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增传代至P8代；S3：工作细胞库：取步骤S2中P8代细胞，进行细胞特性和异源物质检测，检测合格后，即为工作细胞，将其进行消化冻存，并转移至工作细胞库待用；S4：用于帕金森病的治疗制剂的配制：将步骤S3的工作细胞进行贴壁培养，待细胞生长至对数生长期时将细胞进行消化并计数；然后在0-4度条件下将工作细胞溶液与塑形剂按体积比1：1进行混合；所述工作细胞溶液的浓度为100微升2.5x106个工作细胞；所述塑性剂为Matrigel与0.4％羧甲基纤维素钠溶液按体积比1:1进行混合。2.如权利要求1所述的经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述原代神经干细胞来自灵长类动物或啮齿类动物。3.如权利要求1所述的经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂的制备方法，其特征在于，步...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵雄飞，郑佳威，黄倩莹，
申请(专利权)人：上海安集协康生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31