饲料添加菌剂及其制备方法、菌株筛选方法技术

本发明专利技术提供了一种饲料添加菌剂及其制备方法，主要包含枯草杆菌(Bacillus subtilis)及短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，其内含的总菌数约每公克至少1x10

Feed additive bacterial agent and preparation method thereof and bacterial strain screening method

The present invention provides a feed additive and a preparation method thereof, including Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) and Bacillus pumilus (Bacillus pumilus), total number of bacteria per gram of its contents about at least 1x10

【技术实现步骤摘要】
饲料添加菌剂及其制备方法、菌株筛选方法
本专利技术涉及一种饲料添加菌剂及其制备方法，尤指一种可利用解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)或其组合添加碳酸钙粉末后所制成的饲料添加菌剂及其制备方法。
技术介绍
畜牧农业的发展已伴随着人类社会数百年的历史，近年来，用于禽畜类的饲料，为了其功能性而参入许多种类的饲料添加剂。而一般常见的饲料添加剂功能包括增加动物摄食量、提高动物生产力、提高健康水平、改善饲料质量、调节动物生理过程、提高动物相关产品质量以及改善环境状况等。其中，也有帮助动物吸收饲料营养的饲料添加剂，一般这类饲料添加剂属于微生物制剂的一种。以往微生物制剂大多以乳酸菌类为主，但若使用单一菌种或仅使用纯乳酸菌，往往可获得的效果十分有限。近年来人们遂开始寻找其他较为合适的菌株作为研发目标，其中，安全性与有效性皆佳的产孢型非肠道菌类逐渐被人们发现其功效，除了前述的优点外，更可使饲料发挥的效果更加多元化。然而，该类菌株的运用方式中，尚未找到具有多重功效的优良复合制剂。
技术实现思路
为解决现有技术中所提及的问题，本专利技术提供了一种饲料添加菌剂，包含一菌粉以及一填充物。其中该菌粉包含多个菌株，包含一枯草杆菌(Bacillussubtilis)、一短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)或其组合。上述该多个菌株的总菌数为每公克至少1x109菌落形成单位(CFU/g)，且该多个菌株中每一菌株占该饲料添加菌剂的重量百分比相等，而该碳酸钙粉末与该菌粉均匀混合。本饲料添加菌剂所述该枯草杆菌(Bacillussubtilis)的保藏号码为NITEBP-02169，而该短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)的保藏号码为NITEBP-02170。此外，本专利技术更提供了一种饲料添加菌剂的制备方法，首先执行步骤(a)，挑选一菌株接入一第一种瓶中活化，该菌株为一枯草杆菌(Bacillussubtilis)、或一短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。接着执行步骤(b)，再将该第一种瓶中该菌株的菌落接入一第二种瓶中放大，该第二种瓶的容量大于该第一种瓶，其后执行步骤(c)，通过一接种箱再将该菌株接入一发酵槽同时活化放大，直至该菌株进入对数生长期。再执行步骤(d)，将该菌株打入一发酵罐直至该菌株孢子化，并制备为一菌粉，之后执行步骤(e)，重复步骤(a)～(d)直至该枯草杆菌(Bacillussubtilis)及该短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)皆制备为该菌粉并均匀混和，且该枯草杆菌(Bacillussubtilis)及该短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)占该菌粉的重量百分比相等，最后，执行步骤(f)，将该菌粉与一填充物均匀混合。本饲料添加菌剂的制备方法所述该枯草杆菌(Bacillussubtilis)的保藏号码为NITEBP-02169，而该短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)的保藏号码为NITEBP-02170。本专利技术更提供了一种一种菌株筛选方法，包含步骤(甲)，选取一土壤作为样本，接着执行步骤(乙)，取一重量之该样本加入无菌水中，依序于一第一条件及一第二条件中培养，再执行步骤(丙)，将该样本序列稀释为104～107倍，得到一样本稀释液。接着执行步骤(丁)，将该样本稀释液涂抹于对应的筛选培养基，以一第三条件培养，获得如请求项1所述之复数个菌株，最后依序执行步骤(戊)对该复数个菌株鉴定其16SrDNA序列及淀粉、纤维、脂质、蛋白质、钙磷、铁磷、铝磷分解能力是否符合标准，以及步骤(己)将符合标准的该复数个菌株保存。附图说明图1是本专利技术饲料添加菌剂的菌株筛选方法流程图。图2是本专利技术饲料添加菌剂的制备方法流程图。具体实施方式为能了解本专利技术的技术特征及实用功效，并可依照说明书的内容来实施，兹进一步以如图式所示的较佳实施例，详细说明如后：本实施例所述的饲料添加菌剂包含菌粉及填充物，其中该填充物可为碳酸钙粉末或麦芽糊精，且该填充物占该饲料添加菌剂的重量百分比为98％，且该饲料添加菌剂含水量的重量百分比为10％以下。其中该菌粉包含多个菌株，包含一枯草杆菌(Bacillussubtilis)、一短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)或其组合。又，在其他实施例中，该复数个菌株更可包含一解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。而上述的菌株是通过如下方式筛出：请参照图1，图1是本专利技术饲料添加菌剂的菌株筛选方法流程图。所述的多个菌株是通过土壤筛选而得，首先执行步骤(甲)，选取一土壤作为样本。该土壤的质地为砂壤土(Sandsilt)，更精确地来说，是为中国台湾屏东县长治乡联发生物科技股份有限公司场内的土壤。接着，执行步骤(乙)，取一重量的该样本加入无菌水中，依次在一第一条件及一第二条件中培养。在本实施例中，首先会取1公克的样本加入50毫升的无菌水中，接着以第一条件，也就是在室温28℃下培养24小时，接着再以第二条件28℃的条件下培养16小时。再执行步骤(丙)，将该样本序列稀释为104～107倍，得到一样本稀释液。本实施例中所述的序列稀释是以序列稀释涂盘的方式进行，取1毫升的样本液体加9毫升的无菌水，依照技术人员的需求稀释为104～107倍。接着执行步骤(丁)，将该样本稀释液涂抹于对应的筛选培养基，以一第三条件培养，获得如前述的多个菌株。本实施例是将前述的每1毫升的样本稀释液涂于相对应筛选培养基上，培养基可选自营养洋菜培养基(NutrientAgar,NA)或马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PotatoDextroseAgar,PDA)，再以第三条件28℃培养24小时后，观察其菌相及菌数。接着执行步骤(戊)，对该多个菌株鉴定其16SrDNA序列及淀粉、纤维、脂质、蛋白质、钙磷、铁磷、铝磷分解能力是否符合标准。本实施例中，该多个菌株对于淀粉、纤维、脂质、蛋白质、钙磷、铁磷、铝磷的分解能力是通过在培养基中参杂该些物质并观察其代谢反应或检测其产物而得；而16SrDNA的序列可以透过次世代定序(NextGenerationSequencing,NGS)等方式判断，本专利技术不以此为限。最后，执行步骤(己)，将符合标准的该多个菌株保存。本实施例是将该多个菌种纯化后再以甘油(Glycerol)制作为冻管保存于-80℃的冷冻装置中。本实施例所筛选出解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的品系编号为AGB-F002，该枯草杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)AGB-F002及短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)其16SrDNA基因序列的特征依序如序列表SEQIDNO.1、SEQIDNO.2及SEQIDNO.3所示。上述该多个菌株的总菌数为每公克至少1x109菌落形成单位(CFU/g)，且每一该多个菌株占该饲料添加菌剂的重量百分比相等，而该碳酸钙粉末与该菌粉均匀混合。在本实施例中，将举以实际用于农畜动物身上的实例以及实验数据，证明本专利技术族具有优异的功效及进步性。实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种饲料添加菌剂，其特征在于其包含：一菌粉，包含多个菌株，其中该多个菌株包含一枯草杆菌、一短小芽孢杆菌或其组合，该多个菌株的总菌数为每公克至少1x10

【技术特征摘要】
1.一种饲料添加菌剂，其特征在于其包含：一菌粉，包含多个菌株，其中该多个菌株包含一枯草杆菌、一短小芽孢杆菌或其组合，该多个菌株的总菌数为每公克至少1x109菌落形成单位，且该多个菌株中每一菌株占该饲料添加菌剂的重量百分比相等；以及一填充物，与该菌粉均匀混合。2.如权利要求1所述的饲料添加菌剂，其特征在于该填充物为碳酸钙粉末或麦芽糊精，该填充物占该饲料添加菌剂的重量百分比为98％。3.如权利要求1所述的饲料添加菌剂，其特征在于该饲料添加菌剂含水量的重量百分比为10％以下。4.如权利要求1所述的饲料添加菌剂，其特征在于该多个菌株的16SrDNA序列为：枯草杆菌为SEQIDNO.1的序列；短小芽孢杆菌为SEQIDNO.3的序列；且该枯草杆菌的保藏号码为NITEBP-02169；该短小芽孢杆菌的保藏号码为NITEBP-02170。5.一种饲料添加菌剂的制备方法，其特征在于其包含步骤：(a)挑选一菌株接入一第一种瓶中活化，该菌株为一枯草杆菌或一短小芽孢杆菌；(b)再将该第一种瓶中该菌株的菌落接入一第二种瓶中放大，该第二种瓶的容量大于该第一种瓶；(c)通过一接种箱再将该菌株接入一发酵槽同时活化放大，直至该菌株进入对数生长期；(d)将该菌株打入一发酵罐直至该菌株孢子化，并制备为一菌粉；(e)重复步骤(a)～(d)直至该枯草杆菌及该短小芽孢杆菌皆制备为该菌粉并均匀混和，且该枯草杆菌及该短小芽孢杆菌占该菌粉的重量百分比相等；以及(f)将该菌粉与一填充物均匀混合；其中，该枯草杆菌的保藏号码为NITEBP-02169；该短小芽孢杆菌的保藏号码为NITEBP-02170。6.如权利要求5所述的饲料添加菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(b)中该第一种瓶的容量为100毫升，该第二种瓶的容量为2公升。7.如权利要求5所述的饲料添加菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(c)中该发酵槽的容量为500公升。8.如权利要求5所述的饲料添加菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(c)中的活化放大条件为通气量0.03vvm、转速80r.p.m.及温度35℃。9.如权利要求5所述的饲料添加菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(d)中该发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：高婉容，黄俊男，魏伟胜，陈敏敏，杨逸至，林俊良，
申请(专利权)人：联发生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71