一种抗胶孢炭疽菌的铁皮石斛的培育方法技术

本发明专利技术涉及一种抗胶孢炭疽菌的铁皮石斛的培育方法，该方法由原球茎诱导、EMS(甲基磺酸乙酯)诱变原球茎、原球茎的分化和采用针刺法进行抗性筛选四个步骤组成。本发明专利技术所述培育方法的效率高，重复性好，且诱变后代易稳定遗传，具有较好的推广价值。

Method for culturing Dendrobium candidum with anti spore anthrax

Dendrobium candidum cultivation method of the invention relates to a resistance to Colletotrichum gloeosporioides, the method consists of protocorm and EMS (ethylmethane sulfonate) induced protocorm, protocorm differentiation and resistance screening by acupuncture method consisting of four steps. The cultivation method has the advantages of high efficiency, good repeatability, and easy genetic stability for inducing offspring, and has better popularization value.

【技术实现步骤摘要】
一种抗胶孢炭疽菌的铁皮石斛的培育方法
本专利技术涉及通过组织培养技术的植物再生，具体涉及兰科草本植物改良植株的培育方法。
技术介绍
铁皮石斛Dendrobiumofficina/eKimuraetMigo是传统名贵珍稀中药材，具有益胃生津、滋阴清热等功效。野生铁皮石斛生长缓慢、自然繁殖能力极低，由于近年来过度采挖和生态环境的不断破坏，资源濒临灭绝。人工栽培铁皮石斛已成为产业发展的必然趋势。经调查，目前其种苗来源绝大多数为种子无菌萌发获得的试管苗，自由授粉致使铁皮石斛栽培品系复杂，品种内一致性差，世代之间遗传稳定性差。且试管苗多代繁殖变异较多、生存力低，导致种质混乱，退化严重，药材质量不稳定。研究表明栽培铁皮石斛多糖和总生物碱含量差异主要来自遗传变异，品种选育滞后是当前铁皮石斛产业发展的瓶颈。而且，试管苗经过长期继代，种苗长势变差，易感病。经调查发现，炭疽病在铁皮石斛种植区最为普遍、危害严重，发病率高达50％以上，且传染性强，防治较为困难，严重影响铁皮石斛药材的产量和质量。半知菌亚门炭疽菌属的胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)为铁皮石斛炭疽病的主要致病菌，有较强的致病能力，因目前尚无对炭疽病等病害免疫的品种，而化学防治导致农药残留和病原菌耐药性等问题日益突出。因此，采用现代育种技术加速铁皮石斛抗病新品种选育进程已迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种抗胶孢炭疽菌的铁皮石斛的培育方法，该方法所培育出铁皮石斛抗胶孢炭疽菌能力显著增强。本专利技术解决上述技术问题的方案如下：一种抗胶孢炭疽菌的铁皮石斛的培育方法，该方法由以下步骤组成：(1)选取铁皮石斛饱满、近成熟未开裂的蒴果，用体积浓度为75％酒精棉球擦拭，然后置于质量浓度为0.1％汞溶液中消毒15min，再用无菌水冲洗4～5次；取出处理好的蒴果的种子接种于种胚诱导培养基中，于温度为25±2℃、光照强度为2000lx的条件下培养90d，得到铁皮石斛的原球茎；其中所述的种胚诱导培养基为每升含50g马铃薯汁的1/2MS培养基；(2)将获得的原球茎在超净台中加入体积浓度为0.3-0.4％的无菌EMS(甲基磺酸乙酯)溶液，密闭并震荡培养2-3h；接着，用质量浓度为1％硫代硫酸钠处理5s，再用无菌水反复漂洗后接种于原球茎培养基中，于温度为25±2℃，光照强度为2000lx的条件培养45d；然后，挑选分化芽少、芽长健壮、颜色绿和无愈伤的原球茎；其中所述的原球茎培养基为：1/2MS+50g/L马铃薯汁+1g/L酸水解干酪素+0.8g/LHyponex4+2g/L活性炭+30g/L蔗糖和10g/L琼脂，pH值为5.8；(3)将经步骤(2)培养的原球茎在温度为25±2℃和光照强度为2000lx的条件下，依次用含50％与80％体积含量的胶孢炭疽菌粗毒素液的再生培养基培养30d；然后，剔除白化、黄化和根及叶片出现褐化的小苗，而将其余的小苗转入所述再生培养基中继续诱导分化30d；接着，将诱导分化后小苗移至壮苗生根培养基中，在温度为25±2℃和光照强度为2000lx的条件下进行壮苗生根培养60d，得到生根的壮苗；其中，所述的再生培养基为：1/2MS+50.0g/L马铃薯汁+1.0g/L酸水解干酪素+0.8g/LHyponex4+NAA1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+2.0g/L活性炭+30g/L蔗糖和10g/L琼脂，pH值为5.8；所述的壮苗生根培养基为：1/2MS+50g/L马铃薯汁+1.0g/L酸水解干酪素+0.8g/LHyponex4+NAA1.0mg/L+2g/L活性炭+30g/L蔗糖+10g/L琼脂，pH值为5.8；所述的胶孢炭疽菌粗毒素液由以下方法制得：将经过单胞纯菌丝培养，Illumina测序技术鉴定为Colletotrichumgloeosporioides的胶孢炭疽菌菌株于PDA培养基中活化，28℃连续培养7天；用打孔器取出3块直径5mm的菌饼于500mL液体改良察氏培养基中，在25±2℃和100-120r/min的条件下，振荡摇床黑暗培养12d，滤去菌丝后，滤液经10000rpm离心15min，取上清液无菌过滤，即得胶孢炭疽菌粗毒素液；其中所述的改良察氏培养基为：NaNO33g，K2HPO41g，KCl0.5g，FeSO40.01，蔗糖20g，蒸馏水1L；(4)将经步骤(3)培养的壮苗种植于田间，成活后先用解剖针在每片叶子上刺10针，然后涂抹孢子混悬液，每株接种5片叶子；20-25d后进行病情调查，挑选健康的植株，即得抗胶孢炭疽菌的铁皮石斛幼苗；其中所述的胶孢炭疽菌孢子悬浮液由以下方法制得：将试管内保存的炭疽菌，接种于PDA平板培养基上，在28℃暗培养3-4天，挑取菌落边缘菌丝，于PDA平板上28℃暗培养10天，用灭菌的蒸馏水洗脱分生孢子，用消毒的毛笔轻刷菌落表面，过滤，收集孢子悬浮液，用血球计数板计数，使孢子的终浓度为1×106spores/ml，即得胶孢炭疽菌孢子悬浮液。本专利技术所述方法培育出的铁皮石斛具有发病率低，抗胶孢炭疽菌能力强的显著效果。具体实施方式实施例1(抗胶孢炭疽菌的铁皮石斛的培育方法).1、准备工作：(1.1)按以下方法制备种胚诱导培养基：取1/2MS培养基，按每升种胚诱导培养基中马铃薯汁的含量为50g加入马铃薯汁混合均匀，即得。(1.2)按以下方法制备原球茎培养基：分别取1/2MS、50g/L马铃薯汁、1g/L酸水解干酪素、0.8g/LHyponex4、2g/L活性炭、30g/L蔗糖和10g/L1琼脂混合均匀，加入1M氢氧化钠或1M盐酸调节pH值为5.8。(1.3)按以下方法制备再生培养基：分别取1/2MS、50.0g/L马铃薯汁、1.0g/L酸水解干酪素、0.8g/LHyponex4、NAA1.0mg/L、6-BA0.5mg/L、2.0g/L活性炭、30g/L蔗糖和10g/L琼脂混合均匀，加入1M氢氧化钠或1M盐酸调节pH值为5.8。(1.4)按以下方法制备壮苗生根培养基：分别取1/2MS、50g/L马铃薯汁、1.0g/L酸水解干酪素、0.8g/LHyponex4、NAA1.0mg/L、2g/L活性炭、30g/L蔗糖和10g/L琼脂，加入1M氢氧化钠或1M盐酸调节pH值为5.8。(1.5)按以下方法制备胶孢炭疽菌粗毒素液：将经过单胞纯菌丝培养，Illumina测序技术鉴定为Colletotrichumgloeosporioides的胶孢炭疽菌菌株于PDA培养基中活化，28℃连续培养7天；用打孔器取出3块直径5mm的菌饼于500mL液体改良察氏培养基中，在25±2℃和100-120r/min的条件下，振荡摇床黑暗培养12d，滤去菌丝后，滤液经10000rpm离心15min，取上清液无菌过滤，即得胶孢炭疽菌粗毒素液；其中所述的改良察氏培养基为：NaNO33g，K2HPO41g，KCl0.5g，FeSO40.01，蔗糖20g，蒸馏水1L。(1.6)按以下方法制备胶孢炭疽菌孢子悬浮液：将试管内保存的炭疽菌，接种于PDA平板培养基上，在28℃暗培养3-4天，挑取菌落边缘菌丝，于PDA平板上28℃暗培养10天，用灭菌的蒸馏水洗脱分生孢子，用消毒的毛笔轻刷菌落表面，过滤，收集孢子悬浮液，用血本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗胶孢炭疽菌的铁皮石斛的培育方法，该方法由以下步骤组成：(1)选取铁皮石斛饱满、近成熟未开裂的蒴果，用体积浓度为75％酒精棉球擦拭，然后置于质量浓度为0.1％汞溶液中消毒15min，再用无菌水冲洗4～5次；取出处理好的蒴果的种子接种于种胚诱导培养基中，于温度为25±2℃、光照强度为2000lx的条件下培养90d，得到铁皮石斛原球茎；其中所述的种胚诱导培养基为每升含50g马铃薯汁的1/2MS培养基；(2)将获得的原球茎在超净台中加入体积浓度为0.3‑0.4％的无菌EMS溶液，密闭并震荡培养2‑3h；接着，用质量浓度为1％硫代硫酸钠处理5s，再用无菌水反复漂洗后接种于原球茎培养基中，于温度为25±2℃，光照强度为2000lx的条件培养45d；然后，挑选分化芽少、芽长健壮、颜色绿和无愈伤的原球茎；其中所述的原球茎培养基为：1/2MS+50g/L马铃薯汁+1g/L酸水解干酪素+0.8g/L Hyponex 4+2g/L活性炭+30g/L蔗糖+10g/L琼脂，pH值为5.8；(3)将经步骤(2)培养的原球茎在温度为25±2℃和光照强度为2000lx的条件下，依次分别用含50％与80％体积含量胶孢炭疽菌粗毒素液的再生培养基培养30d；然后，剔除白化、黄化和根及叶片出现褐化的小苗，而将其余的小苗转入所述再生培养基中继续诱导分化30d；接着，将诱导分化后小苗移至壮苗生根培养基中，在温度为25±2℃和光照强度为2000lx的条件下进行壮苗生根培养60d，得到生根的壮苗；其中，所述的再生培养基为：1/2MS+50.0g/L马铃薯汁+1.0g/L酸水解干酪素+0.8g/LHyponex 4+NAA 1.0mg/L+6‑BA 0.5mg/L+2.0g/L活性炭+30g/L蔗糖和10g/L琼脂，pH值为5.8；所述的壮苗生根培养基为：1/2MS+50g/L马铃薯汁+1.0g/L酸水解干酪素+0.8g/LHyponex 4+NAA 1.0mg/L+2g/L活性炭+30g/L蔗糖+10g/L琼脂，pH值为5.8；所述的胶孢炭疽菌粗毒素液由以下方法制得：将经过单胞纯菌丝培养，Illumina测序技术鉴定为Colletotrichum gloeosporioides的胶孢炭疽菌菌株于PDA培养基中活化，28℃连续培养7天；用打孔器取出3块直径5mm的菌饼于500mL液体改良察氏培养基中，在25±2℃和100‑120r/min的条件下，振荡摇床黑暗培养12d，滤去菌丝后，滤液经10000rpm离心15min，取上清液无菌过滤，即得胶孢炭疽菌粗毒素液；其中所述的改良察氏培养基为：NaNO...

【技术特征摘要】
1.一种抗胶孢炭疽菌的铁皮石斛的培育方法，该方法由以下步骤组成：(1)选取铁皮石斛饱满、近成熟未开裂的蒴果，用体积浓度为75％酒精棉球擦拭，然后置于质量浓度为0.1％汞溶液中消毒15min，再用无菌水冲洗4～5次；取出处理好的蒴果的种子接种于种胚诱导培养基中，于温度为25±2℃、光照强度为2000lx的条件下培养90d，得到铁皮石斛原球茎；其中所述的种胚诱导培养基为每升含50g马铃薯汁的1/2MS培养基；(2)将获得的原球茎在超净台中加入体积浓度为0.3-0.4％的无菌EMS溶液，密闭并震荡培养2-3h；接着，用质量浓度为1％硫代硫酸钠处理5s，再用无菌水反复漂洗后接种于原球茎培养基中，于温度为25±2℃，光照强度为2000lx的条件培养45d；然后，挑选分化芽少、芽长健壮、颜色绿和无愈伤的原球茎；其中所述的原球茎培养基为：1/2MS+50g/L马铃薯汁+1g/L酸水解干酪素+0.8g/LHyponex4+2g/L活性炭+30g/L蔗糖+10g/L琼脂，pH值为5.8；(3)将经步骤(2)培养的原球茎在温度为25±2℃和光照强度为2000lx的条件下，依次分别用含50％与80％体积含量胶孢炭疽菌粗毒素液的再生培养基培养30d；然后，剔除白化、黄化和根及叶片出现褐化的小苗，而将其余的小苗转入所述再生培养基中继续诱导分化30d；接着，将诱导分化后小苗移至壮苗生根培养基中，在温度为25±2℃和光照强度为2000lx的条件下进行壮苗生根培养60d，得到生根的壮苗；其中，所述的再生培养基为：1/2MS+50.0g/L马铃薯汁+1.0g/L酸水解干酪素+0.8g/LHyponex4+NAA1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张桂芳，赖小平，黄松，闫小巧，李一凡，
申请(专利权)人：广州中医药大学，
类型：发明
国别省市：广东,44