一种快速检测富贵竹炭疽病病原菌的方法及其应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种快速检测富贵竹炭疽病病原菌的方法及其应用。包括以下步骤：（1）提取待测样品的总DNA；（2）以总DNA为模板，以特异性引物ZM3‑7F和特异性引物ZM3‑7R为引物，对目的片段进行PCR扩增；（3）将步骤（2）的扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶中电泳检测，并分析结果；所述特异性引物ZM3‑7F序列如SEQ ID NO：1所示，特异性引物ZM3‑7R序列如SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术为富贵竹炭疽病快速鉴定、准确监测该病原菌潜伏侵染与否奠定了基础，有利于及早有效的采取防治措施。

A method for rapid detection of pathogen of Anthracnose Fuguizhu bacteria and its application

The invention belongs to the technical field of gene engineering, in particular relates to a method for rapid detection of pathogen of Anthracnose Fuguizhu bacteria and its application. Includes the following steps: (1) extraction of total DNA sample; (2) to the total DNA as template, the specific primers of 7F and ZM3 specific primers ZM3 7R primers for PCR amplification of fragments; (3) the step (2) amplified in 1.2% agarose gel electrophoresis detection, and the results of the analysis; the specific primers ZM3 7F sequence of SEQ ID NO:1, specific primers ZM3 7R sequence as shown in SEQ ID NO:2. The present invention for rapid identification and accurate monitoring of the Fuguizhu anthracnose pathogen of latent infection and not laid the foundation, is conducive to early and effective preventive measures.

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测富贵竹炭疽病病原菌的方法及其应用
本专利技术属于基因工程
，涉及一种特异性引物的快速检测病原物的方法，具体涉及一种快速检测富贵竹炭疽病病原菌的方法及其应用。
技术介绍
富贵竹炭疽病病原菌（龙血树炭疽菌）为半知菌类、炭疽菌属、龙血树炭疽菌ColletotrichumdracaenhophilumD.F.Farr&M.E.Palm。在寄主上，分生孢子盘埋生于表皮下，圆形或椭圆形，突破表皮后，形成黄色分生孢子堆，有刚毛，2-4个细胞，褐色至淡褐色，基部至顶端渐细，118-165µm×3.5-7.3µm，分生孢子梗淡褐色至无色,圆柱状，1-3个细胞，表面光滑，43-55×4.5-7.3µm，平均：47×5.5µm。分生孢子单孢，光滑，无色，两端钝圆，圆柱状或棍棒状，偶有弯曲，19.8-30.6×5.3-7.3µm，平均：25.1×6.1µm。在PDA培养基上，生长速度快，菌落直径10天达85mm，菌落白色至淡粉色，边缘整齐，未见菌核。刚毛淡褐色至深褐色。分生孢子梗淡褐色至无色,圆柱状，1-3个细胞，表面光滑。分生孢子单孢，无色，光滑，两端钝圆，圆柱状或棍棒状，偶有弯曲，20-31×6.2-9.4µm。分生孢子附着孢，单孢，浅褐色至深褐色，圆形或椭圆形，边缘完整，11.7-19×8.2-14.4µm，平均：14.6×10.6µm。该病原菌能够引起富贵竹炭疽病，是广泛发生于富贵竹产区的一种较为严重的叶部及茎部病害。富贵竹炭疽病在世界各国富贵竹产区都有发生，成为富贵竹上主要病害之一，每年都会造成一定的产量损失，严重影响其观赏价值。因此，尽早快速的检测该病原菌对减轻该病害造成的损失具有重要的意义。传统上该病菌的分类和鉴定主要基于形态学特征、致病性测定等。传统的病菌鉴别方法耗时长、灵敏度低以及经验性强，发病植株中分离并鉴定病原菌需要数天时间，难以做到对病害发生的及时监测和有效控制病原菌的传播与病害流行。随着分子生物学的发展，不同分子技术应用于植物病原真菌病害的检测。
技术实现思路
本专利技术为解决富贵竹炭疽病快速鉴定、准确监测该病原菌潜伏侵染与否的技术问题，公开了一种快速检测富贵竹炭疽病病原菌的方法及其应用。为解决上述技术问题，采用以下技术方案：一种快速检测富贵竹炭疽病病原菌的方法，包括以下步骤：（1）提取待测样品的总DNA；（2）以总DNA为模板，以特异性引物ZM3-7F、特异性引物ZM3-7R为引物，对目的片段进行PCR扩增；（3）将步骤（2）的扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶中电泳检测，并分析结果；所述特异性引物ZM3-7F序列如SEQIDNO：1所示，特异性引物ZM3-7R序列如SEQIDNO：2所示。所述步骤（2）中总DNA的最低检测浓度为10pg/μL；目的片段大小为468bp。所述步骤（2）中PCR反应体系为：10×PCRbuffer2.5μL，0.625UTaq酶，dNTPMixture0.4mM，Mg2+3mM，5μmol的特异性引物ZM3-7F和5μmol的特异性引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O补至25μL。所述步骤（2）中PCR反应程序为：95℃预变性3min，94℃变性45s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。所述快速检测富贵竹炭疽病病原菌的方法作为及时快速检测富贵竹炭疽病病原菌、减轻病害损失的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过比对所测序的富贵竹炭疽病与GenBank中炭疽病属中其它近似种的ITS基因的部分序列，利用Primer6.0软件分析，设计出了可用于检测富贵竹炭疽病病原菌（龙血树炭疽菌）的特异性引物，为富贵竹炭疽病快速鉴定、准确监测该病原菌潜伏侵染与否奠定了基础，有利于及早有效的采取防治措施。附图说明图1为富贵竹炭疽病单重PCR引物特异性检测图；其中M：DL600的marker;泳道1：阴性对照；泳道2、3C.dracaehophilum炭疽菌扩增结果；泳道4-22分别是：C.cliviae、C.petchii、C.fructicola、C.karstii、C.boninense、C.asianum、C.acutatum、C.truncatum、C.brevisporum、C.aenigma、C.liriopes、C.scovillei、A.alternata、Fusariumsp.、Curvulariasp.、Bipolarissp.、Exserohilumsp.、Drechslerasp.。图2为富贵竹炭疽病引物灵敏度的检测图；其中M:DL600的marker；泳道1：阴性对照；泳道2-8分别是在25μL的体系中含有10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag、10ag、1agDNA量的扩增结果。图3为富贵竹发病组织的检测图；其中Marker:分子标量DL2000；泳道1:阴性对照；泳道2：对照菌株C.cliviae；泳道3：健康叶片DNA扩增结果；泳道4：标准菌株C.dracaenophilum泳道5-7：发病富贵竹叶片提取DNA扩增结果；泳道8-9：发病富贵竹茎提取DNA扩增结果。具体实施方式1.真菌菌丝的收集取保存的已鉴定菌株（C.dracaehophilum，C.cliviae、C.petchii、C.fructicola、C.karstii、C.boninense、C.asianum、C.acutatum、C.truncatum、C.brevisporum、C.aenigma、C.liriopes、C.scovillei、A.alternata、Fusariumsp.、Curvulariasp.、Bipolarissp.、Exserohilumsp.、Drechslerasp.）接种于PDA平板上，25℃下生长5d，挑新鲜菌丝，接种于装有1／3体积PDB的250mL三角瓶中。25℃120r/min，培养3-4d，至生成大量菌丝团为止。双层纱布过滤，蒸馏水连续冲洗，滤纸吸干水分，置于1.5mL离心管-20℃保存备用。2.真菌DNA的提取采用改进的CTAB法提取真菌菌丝DNA，具体步骤如下：（1）取适量的菌丝（约0.5g）于研钵中，加液氮快速磨成粉末；（2）将样品粉末转移到1.5mL的离心管中，加650μL在65℃水浴锅中预热的CTAB提取缓冲液，然后将离心管放在65℃的恒温水浴中保持45min，每隔10min轻轻的颠倒几次，使粉末和缓冲液混合均匀；（3）12000rpm，4℃离心10min，吸取上清液；（4）加入700μL抽提液I（苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1），轻轻颠倒数次至溶液混匀；（5）12000rpm，4℃离心10min，吸取上清液；（6）加入700μL抽提液I，轻轻颠倒数次至溶液混匀；（7）12000rpm，4℃离心10min，吸取上清液；（8）加入600μL抽提液Ⅱ（氯仿：异戊醇=24：1），反复混匀；（9）12000rpm，4℃离心10min，吸取上清液；（10）加入600μL预冷的异丙醇，轻轻摇匀，放在冰上30min；（11）弃上清，并加入600μL70%的乙醇洗涤沉淀两次；（12）置于无菌操作台上，吹干（约20min）；（1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测富贵竹炭疽病病原菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）提取待测样品的总DNA；（2）以总DNA为模板，以特异性引物ZM3‑7F、特异性引物ZM3‑7R为引物，对目的片段进行PCR扩增；（3）将步骤（2）的扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶中电泳检测，并分析结果；所述特异性引物ZM3‑7F序列如SEQ ID NO：1所示，特异性引物ZM3‑7R序列如SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测富贵竹炭疽病病原菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）提取待测样品的总DNA；（2）以总DNA为模板，以特异性引物ZM3-7F、特异性引物ZM3-7R为引物，对目的片段进行PCR扩增；（3）将步骤（2）的扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶中电泳检测，并分析结果；所述特异性引物ZM3-7F序列如SEQIDNO：1所示，特异性引物ZM3-7R序列如SEQIDNO：2所示。2.如权利要求1所述的快速检测富贵竹炭疽病病原菌的方法，其特征在于：所述步骤（2）中总DNA的最低检测浓度为10pg/μL；目的片段大小为468bp。3.如权利要求1所述的快速检测富贵竹炭疽病病原菌的方法，其特征在于，所述步骤（2）中PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：武海燕，张猛，张亚龙，耿月华，那日松，施艳，马乐乐，汪敏，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41