一种具有体内抗氧化和神经保护功能的白蛤多肽及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于海洋生物技术领域，具体涉及一种白蛤多肽及其制备方法与应用。本发明专利技术所述白蛤多肽的制备方法为取白蛤软体加水匀浆后加入木瓜蛋白酶水解，超滤后收集截留分子量小于10kDa的组分。实验结果表明本发明专利技术所述制备方法制得的白蛤多肽具有很好的抗氧化和神经保护作用，可以用于制备成抗氧化和神经保护药物或者保健品，具有良好的经济和社会效应。

White clam polypeptide with antioxidation and nerve protection function in vivo and preparation method and application thereof

The invention belongs to the field of marine biotechnology, in particular to a white clam polypeptide and a preparation method and an application thereof. The preparation method of the white clam polypeptide of the invention is to take the clam soft ware and add water into the homogenate and add papain to hydrolyze, and collect the components whose molecular weight is less than 10kDa after ultrafiltration. The experimental results show that the white clam polypeptide of the invention prepared by the method has good antioxidant and neuroprotective effect, can be used for preparation of antioxidant and neuroprotective drugs or health products, with good economic and social effect.

【技术实现步骤摘要】
一种具有体内抗氧化和神经保护功能的白蛤多肽及其制备方法与应用
本专利技术属于海洋生物
，具体涉及一种白蛤多肽及其制备方法与应用。
技术介绍
随着社会人口老龄化加剧，与衰老相关的神经变性病在世界范围内发病也呈逐年上升趋势，患病人数逐年增多，其临床表现主要分为两种：运动功能障碍和记忆与认知功能障碍。组织病理学研究表明神经元缓慢渐进性凋亡，大多在神经细胞内存在蛋白质的异常聚集，形成包涵体，提示它们可能具有相类似的发病机制。因此，积极寻找具有缓解细胞凋亡老化、抑制神经毒性蛋白异常聚集作用的生物活性物质，将为衰老相关神经变性疾病的防治提供一定的物质基础。我国海洋面积辽阔，海产品类资源丰富。其中，鱼贝类等水产食品不仅是人类蛋白质的重要来源，而且也显现出多种保健和疾病防治功能，对促进人类健康有很重要作用。贝类性平、味甘、咸，具有滋阴补肾、调中的功效。《本草从新》记载着贝肉下气调中、利五脏、疗消渴的功效。其中，白蛤，学名为四角蛤蜊(Mactraveneriformis,Reeue)，俗称白蚬子、泥蚬子、布鸽头，属瓣鳃纲、真瓣鳃目、蛤蜊科。白蛤是我国沿海常见的底栖经济贝类，其肉细味美、营养丰富。中医认为其肉性味咸寒，有滋阴、利水、化痰、软坚功能，可用于治疗水肿、痰积、癖块、癖瘤、崩漏、痔疮等。每百克白蛤的鲜肉中含蛋白质10.8克，其中包含了9种人体必需氨基酸，且比例适中，属完全蛋白质。然而，国内外有关白蛤的研究大多集中在对其生长环境、养殖繁育、食品加工、种属鉴定上，也有部分对其小分子提取物和多糖类物质在降血糖、抗凝血等方面的研究，而有关白蛤多肽在生物活性方面的研究报道则较少，具有广阔的开发前景。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种具有抗氧化和神经保护功能的白蛤多肽及其制备方法与应用。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案。一种白蛤多肽的制备方法，取白蛤软体加水匀浆后加入木瓜蛋白酶水解，超滤后收集截留分子量小于10kDa的组分。其中，所述白蛤软体为新鲜的白蛤去壳后和内脏后用水清洗3～4次得到。在一些实施方案中，所述匀浆时水的加入量为白蛤软体的体积的2倍。在一些实施方案中，本专利技术所述白蛤多肽的制备方法中，所述木瓜蛋白酶水解前还包括将匀浆后得到的肉糜干燥后加水重溶的步骤。其中，所述肉糜干燥后的重溶时水的加入量为干燥的肉糜的体积的20倍。本领域技术人员还可以按照公知的干燥的方法对白蛤软体匀浆后得到的肉糜进行干燥。优选采用冷冻干燥。在一些实施方案中，所述木瓜蛋白酶水解具体为调节pH至6.0，加入木瓜蛋白酶50～80℃水解4～10小时，灭酶。在一些优选实施方案中，所述木瓜蛋白酶水解温度为60℃以下，所述水解时间6h。进一步的，作为优选，所述木瓜蛋白酶每毫升的酶活力为30000U。作为优选，所述木瓜蛋白酶水解时木瓜蛋白酶的加入量为所述木瓜蛋白酶与底物的体积比为1:400。本专利技术所述制备方法超滤后收集截留分子量小于10kDa的组分。其中，所述超滤经0.45μm水系微孔膜过滤，收集到的滤液再经10kDa的超滤膜截留。在一些实施方案中，本专利技术所述白蛤多肽的制备方法中，所述超滤前还包括酶解液干燥后加水重溶的步骤。其中，所述酶解液干燥后的重溶优选为配制成浓度为20mg/mL的溶液。本领域技术人员还可以按照公知的干燥的方法对木瓜蛋白酶酶解液进行干燥。优选采用冷冻干燥。本专利技术还提供了上述制备方法制得的白蛤多肽。百草枯，学名甲基紫精，是一种强氧化剂，可诱导体内活性氧自由基(ROS)的大量产生，而常被用作秀丽线虫氧化损伤造模的化学试剂。本实施例中以80mM的百草枯溶液诱导秀丽线虫急剧死亡，来建立秀丽线虫的百草枯急性氧化损伤模型，用于评估本专利技术所述白蛤多肽的体内抗氧化能力的强弱。本专利技术将所述白蛤多肽加入到成虫初期的野生型秀丽线虫中培养，加入百草枯对秀丽线虫进行氧化胁迫造模，定时统计秀丽线虫存活的比率，检测所述白蛤多肽对百草枯诱导的氧化胁迫的影响，结果显示本专利技术所述白蛤多肽可以显著提高秀丽线虫在急性氧化胁迫条件下的存活率。表明本专利技术所述白蛤多肽具有较好的体内抗氧化能力。无荧光的DCFH-DA探针可被体内的ROS氧化为呈现绿色荧光的产物DCF，通过检测某一时间点DCF的荧光强度可以间接反映样本中ROS的相对含量。本专利技术将所述白蛤多肽加入到成虫初期的野生型秀丽线虫中培养一定时间后，匀浆、离心收集上清液，加入DCFH-DA探针进行荧光强度检测，检测所述白蛤多肽对秀丽线虫体内ROS水平的影响，结果显示，经本专利技术所述白蛤多肽饲喂后，秀丽线虫体内ROS水平较对照组有一定程度的下降。表明本专利技术所述白蛤多肽能够促进体内ROS的清除而发挥抗氧化能力。超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)是生物体内一种重要的抗氧化酶，能催化超氧化物阴离子发生歧化反应，生成过氧化氢(H2O2)和氧气(O2)，减少相关自由基对机体的氧化损伤。本专利技术将所述白蛤多肽加入到成虫初期的野生型秀丽线虫中培养一定时间后，匀浆、离心收集上清液，测定秀丽线虫匀浆上清液中总蛋白含量和SOD活力。结果显示，本专利技术所述白蛤多肽能显著地提高秀丽线虫体内抗氧化酶SOD的活力，从而增强机体的抗氧化能力。本专利技术还选择了以哺乳细胞为模型，评估白蛤多肽的抗氧化能力。本专利技术利用H2O2对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y进行氧化损伤造模，然后将所述白蛤多肽按100、500、1000μg/mL的浓度加入细胞培养基中培养后，MTT比色法计算细胞存活率。结果显示，本专利技术所述白蛤多肽可显著地缓解双氧水对SH-SY5Y细胞产生的损伤，具有较好的抗氧化作用。因此，本专利技术提供了所述白蛤多肽在制备抗氧化的药物中的应用。在较高温度诱导下，CL2355转基因型的秀丽线虫可泛神经表达人Aβ1-42毒性蛋白(与阿尔兹海默病的发病机制相关)，引起毒性蛋白的聚集，从而导致其化学感知神经元受到损伤，显现出对化学引诱剂的敏感性(即趋化性)下降的表型。本专利技术用所述白蛤多肽处理CL2355秀丽线虫，通过检测线虫上述表型的缓解状况，可评估白蛤多肽对毒性蛋白的聚集的影响。结果显示本专利技术所述白蛤多肽可以缓解Aβ聚集引起的神经毒性。HA759转基因秀丽线虫可在其头部ASH、ASI和尾部PHA、PHB四类神经元中表达HtnQ150(人源亨廷顿蛋白中含150个残基的多聚谷氨酰胺片段polyQ)，在线虫生长发育的过程中，polyQ聚集产生神经毒性，损伤ASH神经元，导致其对高渗环境感知能力和回避行为丧失，因此检测该模型的对高渗条件的避化行为可作为评估ASH神经元功能的一种手段。本专利技术用所述白蛤多肽处理HA759秀丽线虫，通过检测线虫对不利的高渗条件的回避行为，评估白蛤多肽对ASH神经元功能的影响。结果显示经白蛤多肽给药处理后，秀丽线虫HA759对不利的高渗条件的回避行为有改善。表明本专利技术所述白蛤多肽可以缓解polyQ聚集引起的神经毒性。因此，本专利技术提供了所述白蛤多肽在制备神经保护的药物中的应用。本领域技术人员可将本专利技术所述白蛤多肽直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，如填充剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂等，以常规药物制剂方法，制成常用制剂如片剂、胶囊剂、注射液、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂和滴丸剂等。其中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种白蛤多肽的制备方法，其特征在于，取白蛤软体加水匀浆后加入木瓜蛋白酶水解，超滤后收集截留分子量小于10kDa的组分。

【技术特征摘要】
1.一种白蛤多肽的制备方法，其特征在于，取白蛤软体加水匀浆后加入木瓜蛋白酶水解，超滤后收集截留分子量小于10kDa的组分。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶水解前还包括将匀浆后得到的肉糜干燥后加水重溶的步骤。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述超滤前还包括酶解液干燥后加水重溶的步骤。4.根据权利要求1-3任意一项所述的制备方法，其特征在于，木瓜蛋白酶水解具体为调节pH至6.0，加入木瓜蛋白酶50～80℃水解4～10小时，灭酶。5.根据权利要求1-4任意一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁明，郭晓蕾，张婷，黄泽波，汪强强，黄韵璇，
申请(专利权)人：无限极中国有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44